非洲豬瘟以及豬冠狀病毒現場快速檢測技術研究劉斐南京農業大學.pdf

1、非洲豬瘟以及豬冠狀病毒現場快速檢測技術研究報告人：劉 斐南京農業大學 動物醫學院單分子納米生物學實驗室第十一屆李曼中國養豬大會.非洲豬瘟、豬冠狀病毒流行現狀及診斷非洲豬瘟流行現狀。非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，可感染各個年齡段的豬只，其中以強毒力毒株感染引起的高出血性和高致死率為特征，致死率可高達100%。ASF的高傳染性、高發病率和高死亡率，給我國乃至世界養豬業造成了巨大的經濟威脅。2018年-2019年，全球共銷毀約3000萬頭豬，直接經濟損失高達20億美元。至今，ASFV依然在全球范圍內傳播。豬冠狀病毒流行現狀 冠狀

2、病毒是引起仔豬腹瀉的重要病原，主要包括豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)、豬德爾塔冠狀病毒(Porcine delta coronavirus，PDCoV)和豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS-CoV)。各種年齡豬都可發病，尤其是 310 日齡仔豬最易發病。感染豬均以嘔吐、腹瀉、脫水和腸道出血為主要特征，且常常呈現隱性感染或多病原混合

3、感染，給世界各地的養豬業均造成了巨大威脅。PEDV和TGEV是目前分布最廣的豬腹瀉病毒性病原，對哺乳仔豬致死率可達100%；在河南地區豬腹瀉樣本中，PDCoV陽性率達35.06%，與PEDV混合感染率達24.03%；SADS-CoV在2016年于我國廣東首次發現。僅2017年引起國內豬只死亡數達25000頭。檢測方法應用場景什么時候檢測抗體，什么時候檢測抗原？非洲豬瘟 or 豬冠狀病毒如何檢測？檢測方法應用場景 非洲豬瘟以及豬冠狀病毒的準確、快速診斷對于防止疫病的蔓延，快速撲滅和根除尤為重要。病毒感染7-10天后可以檢測到抗體，但通常急性的感染在豬只還未表現出明顯癥狀時，就已死亡，首選核酸檢測

4、。病原學診斷：依賴于活病毒、抗原、基因組的檢測，包括病毒分離，抗原ELISA，熒光抗體檢測，PCR等，目前熒光定量PCR檢測使用較多。血清學診斷：豬感染非洲豬瘟以及豬冠狀病毒后7-10天可出現抗體，而且抗體可以持續很長時間，因為目前沒有ASF、PDCoV以及SADS-CoV疫苗，此方法針對亞急性和慢性的感染，適合大規模的抗體篩查。目前常用檢測技術及優缺點檢測方法優勢缺點病原學檢測病毒的分離與鑒定準確性強，可靠性高，可為后續深入研究病原特性提供重要材料耗時長，不適用于臨床上對病原的快速檢測。電鏡觀察該方法精確度高、快速、靈敏需通過特殊的電鏡儀器，造價昂貴，不適用于大批量的樣本檢測免疫學診斷血清中

5、和實驗操作簡單、檢測快速，適用于大批量樣本檢測抗體間存在交叉反應，特異性不強，且不適用于早期診斷免疫熒光可定性、定位、定量分析，可研究病原在組織細胞中的動態分布耗時長，對實驗室及操作人員技術要求高，不適用于臨床樣本檢測酶聯免疫吸附實驗靈敏度高、特異性強，穩定性號，診斷快速，適用于大量樣本容易產生交叉反應，造成誤檢，具有滯后性分子生物學診斷qPCR/RT-PCR快速，靈敏，準確，特異性高，可定性和定量，可用于早期檢測需要專業儀器，專業人員操作，對引物要求高，熒光染料成本高等溫擴增技術操作簡便、敏感性好，特異性高，診斷快速費用昂貴，易產生氣溶膠污染現場檢測的意義 目前，豬病實驗室診斷技術雖然能夠提

6、供精確的檢測結果，但需要多種儀器設備，操作也比較復雜，依賴專業技術人員在實驗室里才能完成，難以適應病原快速診斷的發展要求?？焖僭\斷技術無需特殊儀器設備可肉眼判讀結果，具有簡便快速、特異性強、敏感性高，實驗結果易保存等優點，并且可以定性或半定量檢測。同時快速診斷技術對試驗設備要求低，便于在基層養殖場實施，為基層獸醫人員和豬場檢測豬病的抗體、抗原提供便捷的檢測手段。隨著快速診斷技術的不斷研究、發展及推廣應用，將有效地促進豬重大疫病的檢測與凈化工作，對提高我國養豬業生產的整體技術水平和公共衛生安全，發揮巨大經濟與社會效益。.冠狀病毒快檢方法的研究進展豬冠狀病毒現場快速診斷的研究CRISPR-Cas1

7、2a結合RT-LAMP技術檢測四種豬腸道冠狀病毒開發了一種基于CRISPR/Cas12a和RT-LAMP的多重核酸檢測平臺，用于檢測PEDV、TGEV、PDCoV和SADS-CoV。無污染單管多重LAMP-Cas12a系統原理示意圖LAMP-Cas12a系統檢測四種豬冠狀病毒的特異性liu et al,2022r豬冠狀病毒現場快速診斷的研究RT-RAA結合CRISPR/Cas12a系統便攜式檢測GII基因型豬流行性腹瀉病毒該研究將RT-RAA與CRISPR/Cas12a系統相結合，建立了一個多路復用、快速、便攜式的PEDV檢測平臺。RT-RAA-CRISPR/Cas12a-FDS系統原理示意圖

8、RT-RAA-CRISPR/Cas12a-FDS系統檢測臨床樣品Qian et al,2022r豬冠狀病毒現場快速診斷的研究RT-LAMP-微流控芯片檢測系統檢測PEDV、PDCoV和SADS-CoV該研究開發了微流控-RT-LAMP芯片檢測系統，可以同時檢測PEDV、PDCoV和SADS-CoV。微流控-RT-LAMP芯片檢測平臺原理示意圖微流控-RT-LAMP芯片檢測系統的穩定性和重復性評價Zhou et al,2020r.非洲豬瘟快檢方法的研究進展非洲豬瘟POCT競爭ELISA檢測ASFV原理圖檢測特異性與靈敏度基于鐵蛋白顯示的競爭性ELISA快速檢測ASFV該研究開發了一種基于鐵蛋白顯

9、示的新型競爭性ELISA，用于快速檢測血清樣品中的ASFV抗體，具有高靈敏度和特異性。Gu et al,2023r非洲豬瘟POCT檢測靈敏度檢測特異性雙抗夾心膠體金試紙條快速檢測ASFV P30抗原開發了一種基于兩種P30單克隆抗體的非洲豬瘟病毒膠體金試帶檢測方法。Zhang et al,2021r非洲豬瘟POCTCRISPR-RPA/LAMP系統檢測ASFV原理圖CRISPR-RPA/LAMP檢測系統的特異性CRISPR/Cas12a結合等溫擴增技術實現一管檢測ASFV核酸開發了CRISPR/Cas12a技術結合LAMP或RPA的ASFV可視化單管檢測系統。Qin et al,2022r非洲

10、豬瘟POCT液滴磁流體技術檢測ASFV原理圖利用磁流控技術檢測臨床樣品基于液滴磁流體技術的快速qPCR檢測ASFV利用磁流控技術，使磁珠在離散的試劑液滴之間捕獲和運輸核酸，用于核酸的提取、純化和擴增。Chen et al,2021r非洲豬瘟POCT信號過濾和放大比色等溫傳感平臺原理圖檢測靈敏度和臨床樣品基于信號過濾和放大比色等溫擴增檢測ASFV開發了一種特定的信號濾波和放大比色等溫傳感平臺（簡稱SFMC），用于ASFV和SARS-CoV-2的超靈敏檢測。He et al,2023r.本實驗室冠狀病毒快檢方法核酸提取技術一步法核酸提取技術該方法主要是通過核酸釋放劑實現樣本中的核酸快速裂解釋放，縮

11、短核酸提取耗時，裂解產物可直接用于核酸檢測。該試劑能夠常溫保存，便于運輸及儲存。采用該核酸釋放劑能夠使整個核酸釋放的過程均在室溫下進行，可有效降低氣溶膠的污染，能有效的保護實驗操作人員的安全。該技術有著快速、安全、穩定、高效、成本低等明顯的優勢。核酸提取技術快速柱式核酸提取使用了一種特殊修飾的玻璃纖維膜，玻璃纖維具有毛細纖維結構，能吸附比同等纖維素濾紙以及硅載體更多的水分，具有流速快、耐高溫、納污能力強的特點，并可以過濾細小的顆粒。與傳統的柱式核酸提取方式相比，該提取方式的提取時間大幅度縮短，且所需的離心力更?。▋H需瞬時離心機即可完成），操作方便，可實現現場快速核酸提取和純化。核酸檢測技術：超

12、快速PCR檢測技術 超快速PCR檢測技術結合了快速變溫擴增檢測技術以及試劑冷凍干燥技術，可以實現核酸快速、便捷、精準檢測。超快速PCR檢測技術對比傳統PCR檢測技術的幾大優勢采用了凍干試劑，試劑常溫保存，配套儀器，操作簡單，自動出具專業報告全封閉的操作系統，降低人為污染和誤差，避免假陽性導致的醫療糾紛采用一步法核酸提取技術，縮短檢測時間核酸檢測技術：超快速PCR檢測技術快速變溫擴增技術在傳統變溫擴增技術的基礎上，我們對PCR儀以及檢測試劑進行了改進，實現了快速升溫降溫，同時Taq 酶的合成速率變高，使擴增時間進一步縮短。核酸檢測技術：超快速PCR檢測技術冷凍干燥技術本研究采用該技術將試劑進行脫

13、水干燥，可實現試劑的常溫運輸和保存。通過液氮塑形和賦形劑的作用，可使凍干試劑呈現規則球狀，能夠實現凍干試劑從凍干容器至試劑包裝（如PCR管、EP管、擴增杯、芯片試劑存儲腔等）的轉移。臨床操作人員僅需加入適當的樣本，即可快速進行PCR反應，避免了繁瑣的人工操作步驟可能帶來的誤差及交叉污染。超快速PCR檢測對比傳統 qPCR 技術具備多種優勢傳統qPCR操作復雜需單獨進行核酸提取所用試劑需低溫保存超快速PCR檢測對比傳統 qPCR的技術區別超快速PCR采用一步法核酸提取無需額外的提取步驟超快速PCR采用凍干試劑試劑可常溫保存運輸方便超快速PCR VS 傳統qPCR優勢試劑常溫保存，運輸方便操作簡單

14、，節省人力檢測時間大幅度縮短檢測設備成本大大降低自動出具專業報告特點凍干試劑完整配套設備全自動封閉操作系統PEDV超快速PCR檢測方法建立PEDV超快速PCR檢測方法引物濃度優化PEDV超快速PCR檢測方法探針濃度優化PEDV超快速PCR檢測方法條件優化探針的最佳濃度確定為0.1 mol/L，引物的最佳濃度確定為0.2 mol/L。PEDV超快速PCR檢測方法建立PEDV超快速PCR檢測方法標準曲線試驗PEDV超快速PCR檢測方法標準曲線建立PEDV超快速PCR標準曲線建立結果顯示，標準曲線Ct值和標準質粒濃度間呈現良好的線性關系，相關系數R2=0.993。PEDV超快速PCR檢測方法建立PE

15、DV超快速PCR檢測方法敏感性試驗PEDV超快速PCR檢測方法特異性試驗PEDV超快速PCR敏感性及特異性試驗結果表明，該方法的最低檢出量為8.63 copies/L，其敏感性及特異性良好。PEDV超快速PCR檢測方法建立PEDV超快速PCR檢測方法批間重復性試驗PEDV超快速PCR檢測方法批內重復性試驗質粒濃度(copies/L)CTCTCT8.6310717.0416.7617.028.6310620.8320.6520.808.6310524.4624.2324.31樣品編號C(MeanS.D.)CV116.940.180.92%220.760.110.46%324.330.130.48

16、%樣品編號C(MeanS.D.)CV118.260.080.44%221.710.180.75%324.480.240.91%質粒濃度(copies/L)CTCTCT8.6310718.18 18.27 18.34 8.6310621.53 21.77 21.84 8.6310524.28 24.44 24.72 PEDV超快速PCR重復性試驗該方法具有良好的重復性，結果可靠穩定。PEDV超快速PCR檢測方法建立RT-PCR方法檢測PEDV臨床樣品超快速PCR方法檢測PEDV臨床樣品PEDV超快速PCR臨床樣品檢測超快速PCR方法和常規RT-PCR方法檢測結果相同，兩者的符合率為100%。PD

17、CoV超快速PCR檢測方法建立PDCoV超快速PCR檢測方法引物濃度優化PDCoV超快速PCR檢測方法探針濃度優化PDCoV超快速PCR檢測方法條件優化探針的最佳濃度確定為0.1 mol/L，引物的最佳濃度確定為0.2 mol/L。PDCoV超快速PCR檢測方法建立PDCoV超快速PCR檢測方法標準曲線試驗PDCoV超快速PCR檢測方法標準曲線建立PDCoV超快速PCR標準曲線建立標準曲線Ct值和標準質粒濃度間呈現良好的線性關系，相關系數R2=0.996。PDCoV超快速PCR檢測方法建立PDCoV超快速PCR檢測方法敏感性試驗PDCoV超快速PCR檢測方法特異性試驗PDCoV超快速PCR敏感

18、性及特異性試驗結果表明，該方法的最低檢出量為3.3010 copies/L，其敏感性及特異性良好。PDCoV超快速PCR檢測方法建立PDCoV超快速PCR檢測方法批間重復性試驗PDCoV超快速PCR檢測方法批內重復性試驗樣品編號C(MeanS.D.)CV116.620.201.03%220.060.271.35%323.750.421.77%樣品編號C(MeanS.D.)CV117.040.100.62%220.620.080.25%323.860.210.92%PDCoV超快速PCR重復性試驗該方法具有良好的重復性，結果可靠穩定。質粒濃度(copies/L)CTCTCT3.3010816.9

19、3 17.06 17.14 3.3010720.56 20.66 20.63 3.3010624.07 23.87 23.63 質粒濃度(copies/L)CTCTCT3.3010816.82 16.51 16.54 3.3010720.33 19.79 20.05 3.3010623.76 23.33 24.17 豬冠狀病毒現場快速診斷的研究CRISPR檢測系統微流控芯片檢測系統超快速PCR檢測系統精準度人為污染風險大人為污染風險大全封閉系統，減少人為污染檢測時間較長，1h長，1.5h較短，40min檢測通量很低，1 個樣本/次很低，1 個樣本/次較高，8個樣本/次試劑、樣品用量多多少操作流

20、程較為復雜較為復雜一步法，簡單、便捷定量能力無，只能定性無，只能定性全定量試劑保存條件低溫保存低溫保存常溫保存，運輸方便檢測成本高高低專業報告手動出具手動出具自動分析，出具報告超快速PCR檢測系統對比CRISPR以及微流控芯片檢測系統在核酸檢測方面具備一定的優勢.本實驗室非瘟病毒快檢方法非洲豬瘟POCT雙重QDM檢測ASFV抗體原理圖雙重QDM檢測ASFV傳感器優化基于QDM的非洲豬瘟病毒抗體檢測本研究建立了一種QDM-P30和P54雙探針和體外預孵育作為QAIS進行血清ASFV抗體超靈敏定量檢測方法，具有快速、簡單、靈敏、現場檢測等優點?；赒DM的非洲豬瘟病毒抗體檢測不同稀釋度的標準陽性血

21、清擬合FIT與稀釋度之間的線性關系QAIS檢測限及線性關系采用QAIS傳感器測量1：10至1：512000不同稀釋度的標準陽性血清，檢測限可達1:64000。線性范圍為1：10001：64000，具有可靠的相關系數（R2=0.9947）基于QDM的非洲豬瘟病毒抗體檢測QAIS特異性與靈敏度比較QAIS傳感器與其他病原體的血清沒有交叉反應性，在實際應用中具有良好的特異性。與市用ASF阻斷ELISA試劑盒和CGICS相比，檢測靈敏度低于QAIS傳感器。QAIS特異性市用ASF阻斷ELISA試劑盒和CGICSQAIS傳感器在同一批次的不同稀釋度下的重現性QAIS傳感器在不同批次的不同稀釋液中的重現性

22、基于QDM的非洲豬瘟病毒抗體檢測QAIS重復性具有良好的批間和批內重復性。QAIS和商用ELISA試劑盒比較基于QDM的非洲豬瘟病毒抗體檢測QAIS 和 ELISA 在真實臨床樣本中的比較研究QAIS只需25分鐘的預處理、預孵育和免疫反應時間即可完成樣品測試，而傳統的ELISA需要90分鐘，操作繁瑣。使用提出的QAIS傳感器和ASF間接ELISA試劑盒驗證了ASFV陰性豬（113）和ASFV陽性豬（38）臨床血清樣本的順應率。符合率達98.7%。非洲豬瘟POCTRAA結合QDMs檢測ASFV原理圖基于RAA的ASFV核酸檢測結合重組酶輔助擴增（RAA）和量子點微球（QDMs），建立了基于熒光樹

23、脂檢測條的豬肉快速ASFV檢測方法，具有快速、簡單、靈敏等優點，具有實現病原體核酸現場診斷的潛力?；赗AA的ASFV核酸檢測RAA-QDMs檢測ASFV的特異性和敏感性檢測含有B646L基因的ASFV質粒模板，檢測限為1拷貝，Ft/Ft+Fc值為0.391。其敏感性和特異性良好。QAIS傳感器在同一批次的不同稀釋度下的重現性QAIS傳感器在不同批次的不同稀釋液中的重現性基于RAA的ASFV核酸檢測模擬樣品分析基于QDMs的試紙條測定對臨床豬肉樣品的靈敏度結果如圖所示。模擬ASFV陽性豬肉樣品100拷貝/g仍可觀察到在T線處的熒光條帶，相應的平均值Ft/Ft+Fc為0.255。模擬樣品檢測靈敏

24、度模擬樣品的檢測非洲豬瘟POCT適合早期診斷的非洲豬瘟sIgA抗體量子點免疫層析檢測方法建立開發了一種口腔液中ASF sIgA抗體的現場即時檢驗量子點免疫試紙條。非洲豬瘟sIgA抗體量子點免疫層析檢測靈敏度檢測口腔液中ASFV黏膜抗體sIgA的高靈敏性檢測，最低檢測限為1:64。非洲豬瘟sIgA抗體量子點免疫層析檢測特異性驗證利用開發的ASFV sIgA抗體量子點免疫熒光試紙條檢測PRV、PCV、PRRV陽性口腔液標準品結果。結果顯示特異性良好。非洲豬瘟sIgA抗體量子點免疫層析檢測臨床樣本檢測利用開發的ASFV sIgA抗體量子點免疫熒光試紙條檢測本實驗室保藏的20份ASFV陰性口腔液臨床樣

25、本和16份ASFV陽性口腔液樣本。本研究建立的檢測方法能夠實現口腔液中ASFV sIgA抗體的特異性檢測。本研究建立方法最早可于感染后第6天檢出，顯著早于商品化試劑盒第16天的最早轉陽時間。非洲豬瘟POCT基于QDM的檢測 VS.其他POCT優勢檢測靈敏度高檢測時間短檢測穩定性高結合小型化儀器檢測更方便特點使用QDM偶聯抗體/抗原核酸檢測結合等溫擴增技術結合試紙條進行定量檢測總結與展望超快速PCR技術與傳統的核酸檢測技術相比有著顯著的優勢：1、檢測時間短：該技術無需復雜的操作和精密的儀器，且采用了一步法核酸提取技術及快速變溫擴增技術，大幅度縮短了檢測時間。2、精準度高，人為污染少：該技術采用了

26、全封閉的操作系統，能有效的避免了大規模操作時的實驗室人為污染。3、試劑的常溫保存：該技術應用了冷凍干燥技術，實現了試劑的常溫保存和運輸。超快速PCR檢測本實驗室建立了多種非瘟現場檢測方法：1、針對ASFV慢性感染、非瘟“耐過豬”等核酸無法檢出的情況，本實驗室的非瘟IgG抗體檢測方法可以實現快速、簡單、靈敏的現場檢測；2、對于早期檢測，可采用本實驗室建立的非瘟sIgA抗體檢測方法，該方法最早可于感染后6天檢出；3、對于急性感染和死亡病例，可采用本實驗室建立的基于等溫擴增的ASFV核酸試紙條檢測，該方法靈敏度最高可達1拷貝。非瘟POCT未來我們將持續對該技術進行改進：1、縮短時間：改善快速變溫擴增技術，進一步縮短擴增時間。2、提升靈敏度：優化檢測條件，進一步提升該方法的靈敏度。3、提高檢測通量：改進檢測儀器，提高該方法的檢測通量，4、實現多病原的同時檢測：結合多病原共檢技術，實現多病原的同時單管檢測。超快速PCR檢測未來，我們將進一步開發針對ASFV的快速、靈敏的現場檢測，如：抗體和核酸共檢試紙條、基于試紙條的高通量檢測等。致謝u 單衍可u 易煒婕u 馮余凡u 姬晶晶u江蘇省重點研發計劃u江蘇省農業科技自主創新資金u教育部“動物健康與食品安全”國際合作聯合實驗室u 李嘉豪u 趙伊然u 何昭群u 李鵬歡迎交流合作！Email: