該步驟將 CrtW 和 CrtZ 基因用 CRISPR/Cas9 操作系統或隨機整合方法分開或串聯插入到 XK17、IF015、YC607 這三株高產β-胡蘿卜素的解脂耶氏酵母工程菌株的基因組特定位點。CRISPR/Cas9 操作系統可將無標記基因靶向整合到解脂耶氏酵母基因組的特定位置。該系統將單鏈導向 RNA（sgRNA）與 RNA 聚合酶Ⅲ（Pol Ⅲ）-tRNA 雜合啟動子相結合，構建用于基因敲除和整合的 CRISPR-Cas9 表達質粒 pCRISPRyl。另一方面，在解脂耶氏酵母模式菌 Polf 基因組上篩選出多個基因整合效率較高的位點，構建了帶有 hrGFP 表達盒的同源供體質粒 HR Donor。最終，通過共轉化 pCRISPRyl 和重組 HR Donor 實現目的基因的整合。