非洲豬瘟疫苗的研制;現狀和未來反方向道格拉斯·格萊德, 美國農業部.pdf

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1、用于控制非洲豬瘟(ASF)的疫苗開發:我們的研究現狀以及研究方向Douglas Gladue,PhD資深科學家:Plum Island Animal Disease Center-USDA-ARS科學主管:Global African Swine Fever Research Alliance財務主任:World Society for VirologyDouglas.Gladueusda.gov 非洲豬瘟病毒非洲豬瘟病毒 非洲豬瘟病毒：非洲豬瘟病毒病毒科雙鏈DNA基因組長度170-190kb 150+基因極少地被詳細研究過(大約20）對亞臨床感染有很高的致死率（100%）出血、水腫、腹水和休

2、克 野豬、疣豬、家豬病毒/宿主因素導致了不同的結果 仍然不甚了解 不同毒株的毒性 不同的宿主物種癥狀/致死率 長期的持續/潛伏感染 在豬群中傳播地快速且強效非洲豬瘟病毒非洲豬瘟病毒:傳播傳播 在糞便中數天 在受污染的圍欄里幾個月 在冰凍的尸體中多年 豬肉產品：在鹽漬/干火腿中，發現時已超過生產日期140天。泔水喂養、垃圾、廢棄物2019年3月17日，聯邦調查局查獲100萬磅從中國走私到新澤西州港口的豬肉2020年8月，美國海關辦公室查獲201磅豬肉藏在 卡車發動機艙內的豬肉2020年6月19日，洛杉磯和長灘的港口。繳獲19,555磅來自中國的違禁肉制品(報道來自：洛杉磯時報)肯尼亞1921歐洲

3、零爆發1990s葡萄牙1957巴西1970s根除ASF非洲豬瘟的爆發 非洲以外:大部分是零星的爆發，在國家之間的傳播有局限性 未煮熟/未煮透的豬肉制品 (進口，非法)葡萄牙、西班牙、意大利、比利時 機場或航運港口的生豬肉廢料/垃圾 里斯本、馬耳他、撒丁島 西班牙 1960意大利1983比利時1985馬耳他撒丁島1978非洲豬瘟在非洲一直處于地方性流行狀態非洲豬瘟的爆發 非洲豬瘟在非洲一直處于地方性流行狀態ASFV in 2005 肯尼亞1921歐洲零爆發1990s葡萄牙1957巴西1970s根除ASF西班牙 1960意大利1983比利時1985馬耳他撒丁島1978從格魯吉亞的單一疫情而導致的非

4、洲豬瘟大爆發2007-20162007中國中國 Aug 2018格魯吉亞格魯吉亞2007高加索地區高加索地區 俄羅斯俄羅斯 2007蒙古蒙古Jan 2019越南越南Feb 2019柬埔寨柬埔寨April 2019香港香港朝鮮朝鮮 May 2019老撾老撾June 2019菲律賓菲律賓July 2019緬甸緬甸比利時比利時Aug 2019印尼印尼Nov 2019東帝汶東帝汶韓國韓國June 2019巴布亞新幾內亞巴布亞新幾內亞March 2020 印度印度Jan 2020拉脫維亞拉脫維亞愛沙尼亞愛沙尼亞白俄羅斯白俄羅斯波蘭波蘭2014烏克蘭烏克蘭 2012德國德國Sept 2020 肯尼亞192

5、1歐洲零爆發1990s葡萄牙1957巴西/加勒比海地區 1970sEradicated 非洲豬瘟的爆發軌跡 匈牙利匈牙利April 2018Iran2008馬來西亞馬來西亞Feb 2021多米尼加多米尼加共和國共和國April 2021海地海地Nov 2021不丹不丹May 2021泰國泰國Jan 20222022 ASFV 大流行2021年：傳入多米尼加共和國 在西半球的首次爆發第五屆第五屆GARA科學會議，蓬塔卡納，多米尼加共和國科學會議，蓬塔卡納，多米尼加共和國 2022年年5月月 Global African Swine Fever Research Alliance全球非洲豬瘟研究聯

6、盟全球非洲豬瘟研究聯盟https:/www.ars.usda.gov/GARA/網絡研討會:ASFV疫苗研究 May 2021:GARA Scientific Communications-YouTube網絡研討會:ASFV 基因測序:GARA Scientific Communications-YouTubeASFV 疫苗缺口疫苗缺口:病毒蛋白的保護性免疫力未知 難以制造亞單位疫苗 所有嘗試都是失敗的，或者只能提供少量的保護率 成功的亞單位疫苗都是針對低毒性毒株的 需要大劑量-在商業上不可行 即使在大劑量作用下，滅活疫苗也不能提供很好的保護 不可能使用滅活疫苗 目前唯一的選擇是減毒活疫苗 毒

7、性減弱的分離物是由:低毒性水平的分離物 所有公布的疫苗都有殘余的毒力 通過組織培養過程以減弱病毒毒性 病毒的適應性導致了豬體內復制能力的喪失（并非疫苗）進行過基因刪除的病毒減毒活疫苗減毒活疫苗(LAV)可以高效完成可以高效完成 抵抗抵抗同源性同源性病毒病毒的的任務任務美國農業部（USDA)非洲豬瘟疫苗平臺 ASFV減毒活疫苗可以防衛非洲豬瘟格魯吉亞株(ASFV-G)ASFV-G 9GL Journal of Virology 2015 Aug;89(16):8556-66 9GL首次被確定為毒性確定物，Lewis等人完成毒性物分離：馬拉維 在單次，低劑量下有保護作用 V在較高劑量下具有病毒性

8、需要進一步毒性減弱ASFV減毒活疫苗可以防衛非洲豬瘟格魯吉亞株(ASFV-G)ASFV-G-9GLUK UK：Zsak等人在E75分離株中首次將其確定為毒力因子刪除UK基因可使病毒減弱至少100倍 在104 HAD50 的時候接種一次就能誘導保護 完成雙重基因刪除的減毒活疫苗可以抵御目前爆發的ASFV-G毒株ASFV-G-MGF 6個MGF基因的缺失 單一低劑量時有保護作用 高劑量時無臨床癥狀，一天輕度發燒 定制一個考慮到了不同來源的生物信息學和功能性基因組數據的計算途徑 I177L:可預測的免疫調節蛋白 基因刪除I177L讓其成為最優的非洲豬瘟候選疫苗(ASFV-G-I177L)ASFV 減

9、毒活疫苗#3:新的基因目標關于最小劑量的研究:在 NAVETCO生產的ASFV-G-I177L 越南毒株的分離挑戰 重復USDA公布的最小劑量 102 較高的疫苗劑量沒有臨床癥狀或殘余毒力ASFV-G-I177L 是一種有效的疫苗對本地豬種和歐洲豬種都有效評估ASFV-G-I177L的脫落情況以及向幼豬的傳播情況 78 周齡幼豬 ASFV-G-I177L102.6很明顯，盡管在多次檢驗中可以從所有接種的動物中檢測到疫苗病毒的基因組，但在實驗過程中沒有一頭有感染風險的幼豬出現系統性感染。沒有一只有感染風險的動物產生任何可檢測水平的ASFV抗體，這支持了ASFV-G-I177L在有感染風險的動物中

10、無法系統性復制的說法田野環境下的病毒傳播50頭10周齡的豬接種兩次 102.6 的ASFV-G-I177L10頭具有潛在感染風險的動物在49dpi時被混合在一起 其中3頭的PCR呈陽性10頭具有潛在感染風險的動物有5只產生了ASFV+抗體 在田野條件下，ASFV-G-I177L具有一定的傳播性，因為一些具有感染風險的豬產生了系統性病毒復制和誘導ASFV特異性免疫反應。毒力恢復性的研究68 周齡幼豬ASFV-G-I177L102.8從組 1抽取2ml 集合的血液樣本組 1 組 2 從組 2抽取2ml 集合的血液樣本組 3 從組 3抽取2ml 集合的血液樣本組 4從組 3抽取2ml 集合的血液樣本

11、組 5毒力恢復性的研究從表型上看，ASFV-G-I177L在五次連續的回輸中保持穩定。通過二代測序證實ASFV-G-I177L疫苗的在基因學上是穩定的。成功完成了病毒毒力恢復性研究 疫苗在豬群身上的5個連續回流體現的遺傳穩定性 疫苗在遺傳和表型上都很穩定 檢針對病毒脫落和病毒傳播的大規模實驗證實，即使在不同的條件下，ASFV-G-I177L是一種安全的減毒活疫苗。在越南完成了田野試驗（成功）ASFV-G-I177L 安全評估總結 ASFV-G-I177L 總結 誘導歐洲豬或越南豬的保護作用的IM劑量為 102 HAD50 即使在ON或IM劑量為106 HAD50，也缺乏殘余毒力 針對原始ASF

12、V-G株和最近ASFV-G-越南株的有效疫苗。疫苗實驗室結果在商業規模上得到重復利用 通過完成大規模的安全性研究和毒力恢復性的研究，證實了ASFV-G-I177L是一種安全的疫苗 在所有針對ASFV-G的減毒活疫苗中安全性最高 針對ASFV-G的最有前景的實驗性疫苗ASFV-G-I177L 的限制 只在原代豬巨噬細胞中生長 原代細胞在商業使用上有限制 需要供體動物 分離需要耗費大量時間 監管問題 價格昂貴 無法制作用于疫苗生產的主細胞系 缺少血清學的DIVA(從接種疫苗的動物中區分感染）對細胞系的篩選確定了一個內部細胞系 PIPEC(梅島豬上皮細胞)連續的傳代增加了病毒產量 在第十一代時達到了

13、106-107 滴度呈5-6對數增長PIPEC 細胞 不需要任何特殊的培養基要求 細胞生長迅速 可作為潛在疫苗生產的特點梅島豬上皮細胞(PIPEC)適應了ASFV-G-I177L 的基因組穩定性 病毒在第7、11、20、30位進行了測序 在基因組左側變異區進行了刪除(LVR)修改了10個基因 刪減8個基因，融合2個基因 7個MGF基因 MGF 360-6L,8L,9L,10L&MGF 300-1L,2R,4L X69R 部分ORF的融合:MGF 360-4L&11L 在PIPEC中，基因組變化可以穩定發生多達30位 E119L 的點突變在20-30位傳遞之間.絲氨酸到蘇氨酸ASFV-G-I17

14、7LLVR1R2R3R4R5R6R12L13L14L11L10L9L8L4L2R1LX69R6L4L13Lb13La10L9L7RASFV-G-I177LLVR1R2R3R4R5R6R12L13L14L11L10L9L8L4L2R1LX69R6L4L13Lb13La10L9L7RASFV-G-I177LLVR中的MGF基因的缺失與候選疫苗或其他細胞培養的適應性病毒中的MGF基因不同。1R2R3R4R5R6R12L13L14L11L10L9L8L4L2R1LX69R6L4L13Lb13La10LASFV-CN-MGF110-9L9L7RASFV-CN-MGF505-7R1R2R3R4R5R6R1

15、2L13L14L11L10L9L8L4L2R1LX69R6L4L13Lb13La10L9L7R1LX69R6L4L13Lb13La10L9L1R2R3R4R5R6R12L13L14L11L10L9L8L4L2R7RASFV-G-X69RASFV-BeninMGF 1R2R3R4R5R6R12L13L14L11L10L9L8L4L2R1LX69R6L4L13Lb13La10L9L7RASFV-G-VERO1R2R3R4R5R6R12L13L14L11L10L9L8L4L2R1LX69R6L4L13Lb13La10L9L7R1R2R3R4R5R6R12L13L14L11L10L9L8L4L2R1L

16、X69R6L4L13Lb13La10LASFV-GMGF-USDA1R2R3R4R5R6R12L13L14L11L10L9L8L4L2R1LX69R6L4L13Lb13La10LASFV-HLJ-MGFCD29L9L1R2R3R4R5R6R12L13L14L11L10L9L8L4L2R1LX69R6L4L13Lb13La10LASFV-GMGF9GL-USDA9L在MGF區域的PIPEC適應性突變LVR 與以前研究的其他MGF缺失位置不同 PIPEC 適應性:ASFV-G-I177L LVR 對豬群的有效性:ASFV-G-I177L LVR 和 ASFV-G-I177L 劑量為102 to 1

17、06都會產生類似的低水平病毒血癥 共同飼養的前哨豬群保持陰性（血液和脾臟）早在7dpi就觀察到ASFV-G-I177L LVR的抗體反應與ASFV-G I177L相似 ASFV-G-I177LLVR 可 100%誘發保護作用102 ASFV-G-I177LLVR:疫苗效力ASFV-G-I177LLVR總結 保持親代ASFV-G-I177L的安全狀況 在PIPEC細胞中生長到高滴度 PIPEC細胞是一種適合ASFV疫苗生產的細胞系 針對ASFV-G的最有前景的實驗性疫苗 ASFV 疫苗的發展現狀 項目初始第一階段疫苗的安全和效力第二階段 擴大試驗范圍第三階段實地試驗 注冊/管控批準市場投放ARS

18、 patentLicensing許可證合伙人CRADA.MTRA ASFV-G-I177L Navetco ASFV-G-9GLUK-undisclosedASFV-G-9GLUKASFV-G-MGF (4 Undisclosed Licenses)ASFV-G-I177L (6 undisclosed Licenses)ASFV-G-I177LLVR(5 undisclosed Licenses)1.全球市場的疫苗需求2.美國的疫苗儲備 PIADC 科學家的加入 (5 Undisclosed Licenses)ASFV-G-I177L LVR Navetco ASFV-G-I177L Kom

19、ipharm ASFV-G-I177L LVR KomipharmASFV-G-I177L-Dabaco ASFV-G-I177L LVR-Dabaco ASFV-G-I177L 成為第一個用于非洲豬瘟的商業化產品 首次商業化投入市場60萬劑疫苗 第二代ASFV疫苗：ASFV-G-I177LLVR 第三代ASFV疫苗：血清學DIVA 對I177L的Elisa檢測-與商業伙伴合作的初步結果是非常有前景的 其他DIVA目標(從接種疫苗的動物中區分感染）ASFV-G-I177L 在越南的應用現狀 新聞報道ASFV-G-I177L在沒有密切監督的疫苗使用地區有一定程度的毒性或導致豬群輕度發病 新聞，非

20、數據驅動的研究報告 疫苗接種后7天，表現出癥狀的豬對野生型ASFV檢測呈陽性 疫苗需要21天才能產生免疫力 Navetco疫苗為2劑 在疾病暴發的地區，疫苗的使用沒有得到監督 不按標簽使用可能導致問題 標簽說明僅適用于8-10周齡的健康豬 在沒有任何與疫苗問題有關的報告的地區，無論是否有疾病爆發，都將繼續進行疫苗接種，所有的疫苗接種都將在監督下繼續進行。因此，只有在那三個出現問題，不當使用，或者在沒有監督的情況下使用疫苗的省份，才會暫停疫苗接種。Borca LabElizabeth RamirezAyushi RaiTed SpinardPrevious PIADC:Vivian ODonne

21、ll Keith Berggren Ryan Baker-Branstetter Nino Vepkhvadze Melanie Prarat Jolene Carlson Ignacio Fernandez-Sainz Paige Fletcher Devendra Rai Paul Azzinaro Lauren Holinka-PattersonBrent Stanford Alexia Alfanso Dr.Lu Betty Bishop Peter Krug Michael SingerGladue Lab Nallely EspinozaElizabeth VuonoAlyssa ValladaresPIADC ASFV SYs Ediane SilvaGiselle MedinaJames ZhuNational ProgramCyril Gay致謝！答疑時間Douglas.Gladueusda.govCurrent Funding provided by:ASFVGENOMICS.com 所有ASFV蛋白的結構預測團體驅動力，歡迎提出建議在線測序分析