小藥說藥：抗體偶聯藥物從基礎到臨床（164頁）.pdf

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1、1 目錄 第一章 ADC 的基礎科學與設計原理.2 ADC 的臨床藥理學基礎.2 ADC 有效載荷的研究進展.6 ADC 連接子的研究進展.21 ADC 生物偶聯技術的研究進展.28 ADC 的迭代史.36 第三代 ADC.41 ADC 的耐藥機制.47 ADC 藥物的內吞機制.50 ADC 藥物的免疫原性.55 關于 ADC 治療窗口的新見解.59 第二章 ADC 的藥物開發與評價.63 ADC 非臨床安全性評價的考量因素.63 影響 ADC 藥代動力學的多因素分析.67 抗體偶聯藥物治療指數的討論.70 影響 ADC 療效的關鍵因素.73 ADC 藥物成功設計的關鍵.77 ADC 設計中的

2、靶抗原選擇.81 ADC 連接子的集成設計.86 雙抗 ADC：1+12.91 第三章 ADC 的臨床應用與治療策略.100 ADC 在胃癌治療中的進展與展望.100 ADC 靶向葉酸受體治療卵巢癌的策略.104 ADC 的聯合治療.107 HER2 靶向 ADC 的新發展策略和挑戰.111 盤點靶向 HER 家族的 ADC.118 ROR1 靶向 ADC 的研究進展.123 靶向 TROP-2 ADC 藥物的臨床進展.127 ADC 臨床開發中的經驗教訓.131 第四章 ADC 的先進技術與未來展望.136 ADC 的未來發展.136 新型 ADC.140 海洋生物中發掘的 ADC 新型有效

3、載荷.145 多肽偶聯藥物（PDC）的未來發展方向.151 AOC 的精確控制偶聯方法.155 腫瘤免疫治療時代的放射偶聯藥物.160 2 第一章 ADC 的基礎科學與設計原理 ADC 的臨床藥理學基礎 前言 抗體偶聯藥物（ADC）是由靶向特異性抗原的單克隆抗體與小分子細胞毒性藥物通過接頭連接而成，兼具傳統小分子化療的強大殺傷效應及抗體藥物的腫瘤靶向性。自從第一個ADC（Gemtuzumab-ozogamicin（商品名：Mylotarg）被批準用于治療 CD33 陽性的急性粒細胞白血病以來，已經開發并批準了十幾種用于治療癌癥的 ADC。從選擇合適的抗體到最終產品，ADC 的整個開發過程都是一

4、項艱巨而富有挑戰性的任務。臨床藥理學是藥物開發的最重要工具之一，利用這一工具有助于找到產品的最佳劑量，從而在患者群體中保持產品的安全性和有效性。與其他小分子或大分子通常僅測量一個部分和/或代謝物以進行藥代動力學分析不同，ADC 需要測量多個部分以表征其 PK 特性。因此，深入理解 ADCs 的臨床藥理學對于在患者群體中選擇安全有效的劑量至關重要。ADC 的藥代動力學概述 藥代動力學是臨床藥理學和現代藥物開發過程中不可缺少的一部分。藥代動力學研究的主要目的是獲得有關藥物的吸收、分布容積、清除率、半衰期、多次給藥后的累積、各種疾病狀態下以及年齡、體重和性別對藥物藥代動力學的影響的信息。這些藥代動力

5、學參數可用于設計患者的最佳給藥方案。應該認識到，與小分子和治療蛋白（抗體或融合蛋白）不同，ADC 的 PK 非常復雜，因為 ADC 由幾個組成部分組成。不僅要考慮單抗的 PK，還要考慮細胞毒性分子的 PK 以及結合的物化性質。由于單抗的分子量占到了 90%以上，因此 ADC 的不同組分的 PK 受其 PK 的影響很大?？偪梗ˋDC+mAb）的 PK 特征提供了 ADC 穩定性和完整性的最佳評估。偶聯物和偶聯位點在維持 ADCs 的穩定性和 PK 中也起著重要作用。下表列出了 FDA 批準的 ADC及其 PK 的特性。ADC 的藥代動力學特征 一般來說，在給藥后，體內涉及四個過程。這些過程是吸收

6、、分布、代謝和清除。3 吸收 大多數抗體通常通過靜脈注射或輸液途徑給予，抗體也可以通過皮下（SC）途徑給予。然而，對于 ADC，目前給藥途徑是靜脈注射或輸液。由于對細胞毒性有效載荷的反應和細胞毒性物質的局部沉積，SC 給藥可能不適用于 ADC。分布 藥物在體內的分布可以用分布容積來描述。由于其大小和極性，抗體和 ADC 的分布通常局限于血管和間質間隙。ADCs 的初始分布一般局限于血管，其分布容積一般等于血容量。隨后，ADCs 可以分布到間質間隙。此外，ADC 分布也會受到靶抗原表達和內吞的影響。ADC 在同一組織中的分布和積累會產生不良的（毒性）藥理學影響，這是由于 ADC 的攝取后的細胞毒

7、性藥物或代謝物的釋放。代謝 ADC 體內分解/代謝過程包括抗體分解代謝過程和小分子藥物體內代謝。ADCs 在到達腫瘤細胞前，在細胞內（non-cleavable linker）或者循環系統中（cleavable linker）釋放效應分子，未結合的抗體和抗體片段遵循抗體的代謝途徑通過酶解產生氨基酸，被機體重新利用。ADC 裂解或被分解代謝后可能形成的游離的小分子藥物和/或連有氨基酸殘基的小分子藥物和/或 linker 的小分子藥物代謝物，會進一步經歷肝 CYP450 酶代謝，還可能發生潛在的藥物藥物相互作用。除了 ADC 本身性質外，抗原的表達、受體/細胞密度，FcRn 介導的循環作用、與 F

8、c作用、受體介導的內吞作用、免疫原性等都會影響 ADC 的分解代謝。清除 ADC 也是通過分解代謝和排泄的方式進行消除。ADC 可通過與靶點結合的特異途徑，進入溶酶體后發生降解，釋放小分子藥物后從體內清除；還可以通過非特異的胞飲作用進行清除，該途徑涉及新生兒受體（FcRn）參與的循環再利用過程。ADC、抗體、分子量較大的多肽及氨基酸片段無法通過腎小球濾過排泄，而是以氨基酸的形式重新吸收利用。游離小分子藥物、分子量較小的多肽及氨基酸連接的小分子藥物、分子量較小的抗體片段可通過腎小球濾過進行排泄。同時，小分子藥物及代謝產物也可經酶代謝消除或通過轉運體排泄至糞便中。ADC 的生物分析 ADC 有幾種

9、組分，為了表征這些組分的 PK 特征，需要幾種分析方法，如下所述：ELISA 免疫分析測定結合物和總抗體的動力學曲線；TFC-MS/MS，對游離藥物/代謝物進行定量；高分辨質譜用于體內藥物抗體比（DAR）分析。此外，兩種類型的 ELISA 免疫分析用于定量測量 ADC 的分析物：第一種類型的分析測量總抗體，即 DAR 大于或等于零的 ADC。第二種分析方法測量藥物結合抗體，定義為 DAR大于或等于 1 的 ADC。其它分析方法有尺寸排阻色譜法（SEC）和疏水作用色譜法（HIC）。SEC 是最常用的液相色譜（LC）技術，用于測定抗體的聚集數量，該技術也可用于 ADC。雖然 HIC 是一種用4 于

10、蛋白質分離、純化和表征的傳統技術，但是這種技術現在正被用于 ADC 表征和分析。細胞毒性有效載荷 ADC 細胞毒性有效載荷應具備以下特性:具有細胞毒性的有效載荷應具有恰當的脂溶性。有效載荷的靶標應位于細胞內部。有效載荷的分子應該是小尺寸的，缺乏免疫原性，可溶于水緩沖液，以便可以很容易地偶聯。有效載荷在血液中應該是穩定的。目前，常用的細胞毒性藥物效應分子為微管抑制劑（如：auristatins、maytansinoids）、DNA 損傷劑（如 calicheamicin、duocarmycins、anthracyclines、pyrrolobenzodiazepine dimers）和 DNA

11、轉錄抑制劑（Amatoxin 和 Quinolinealkaloid(SN-38)）。已經獲批上市的幾個 ADC藥物共使用了 6 個不同的小分子藥物，其中有 3 個 ADC 藥物使用 MMAE 作為偶聯藥物，2個藥物使用 Calicheamicin 作為偶聯藥物，另外成功應用的還有 MMAF，DM1，SN-38，Dxd。藥物抗體比（DAR）藥物抗體比（DAR）是指附著在單個單抗上的有效載荷分子的平均數量，通常在 2 到 4個分子之間。在極少數情況下，通過使用親水鏈接器有效載荷可以安全地實現高達 8 的 DAR，如 Enhertus 和 Trodelvys。DAR 對 ADCs 療效的測定非常重

12、要，此外，DAR 可能影響藥物在循環中的穩定性、PK 和 ADC 的毒性。研究表明，與 DAR 值6 的 ADCs 相比，DAR 值高（7 到 14）的 ADCs 清除速度更快，體內療效降低。DAR 值及其對穩定性和 PK 的影響也取決于偶聯位置和接頭的大小。賴氨酸或半胱氨酸通常被修飾以產生 ADC。賴氨酸是連接底物和抗體的最常用的氨基酸殘基之一,賴氨酸通常存在于抗體表面,因此容易偶聯。Mylotargs、Kadcylas 和 Besponsas都使用賴氨酸生物結合技術。其他氨基酸如半胱氨酸和酪氨酸也可以修飾，用馬來酰亞胺修飾半胱氨酸合成了Adcetriss、Polivys、Padcevs、E

13、nhertus、Trodelvys 和 Blenreps 等 ADC。連接子 連接子（linker）是 ADC 不可或缺的一部分,它決定 ADC 的藥物釋放機制、PK、治療指數和安全性。早期的 ADC 連接子是化學不穩定的，如二硫化物和腙。這些連接子在循環中不穩定，半衰期短，一般為一到兩天。最新一代的連接子在體循環中更穩定，如肽和葡萄糖醛酸連接體。兩個最常見的連接體如下：可裂解連接子 裂解型 linker 對細胞內環境敏感，在細胞內通過分解代謝和解離共同作用釋放出游離的效應分子和抗體，如酸裂解連接子和蛋白酶裂解連接子。它們通常在血液中穩定，但在低 pH和富含蛋白酶的溶酶體環境中會快速裂解，釋放

14、效應分子。此外，如果效應分子可以跨膜，則可通過發揮潛在的旁觀者效應消滅腫瘤。不可裂解連接子 5 不可裂解的 linker 是一種新一代的連接子，與可裂解的連接子相比，它具有更好的血漿穩定性。由于不可裂解的連接子可以提供比可裂解連接子更大的穩定性和耐受性，因此，這些連接子降低了靶外毒性，也提供了更大的治療窗口。免疫原性 在針對 8 個 ADC 的 11 個臨床試驗中，ADAs 的基線發生率在 1.4%到 8.1%之間，基線后 ADAs 的發生率在 0-35.8%之間，這些數值在治療性單克隆抗體的范圍內?？偟膩碚f，ADCs的 ADA 發生率在靶向血液腫瘤的患者比靶向實體腫瘤的患者少；大多數 ADA

15、 是針對 ADC的單克隆抗體結構域的。此外，在大多數患者中，這些 ADC 的半抗原樣結構并不比治療性單克隆抗體產生更多的免疫應答風險。ADC 藥代動力學模型 應用模型的方法可以將 PK、藥效和安全性數據進行整合，以滿足不同階段 ADC 藥物研發的需求，如：靶點的選擇、抗體的親和性、linker 的穩定性、動物到人的外推、劑量的選擇和調整、E-R 相關性研究（exposure-response relationships）、DDI 研究等等。由于 ADC具有多種清除途徑（解離和分解代謝），以及存在多種分析物的復雜的 PK 特征，使得其動力學模型也較為復雜。不同的模型具有不同的應用，如可采用二房室

16、模型和 PBPK 模型可以用清除率、解離、代謝速率等參數描述 ADC 的穩定性特征。目前非房室模型、群體藥代模型、基于機制的模型、基于生理的模型在 ADC 藥物動力學研究中均有應用。小結 在 ADC 藥物的研發進程中，臨床藥理學起著非常重要的作用，通過不斷發展的生物分析技術，深入全面地闡明 ADC 藥物的 PK/PD 特征，對于推動研發出更加低毒高效的 ADC 藥物至關重要。ADC 藥物也必將在腫瘤治療領域展現出更加強大的優勢。參考文獻：1.Clinical Pharmacology of Antibody-Drug Conjugates.Antibodies(Basel).2021 May2

17、1;10(2):20.6 ADC 有效載荷的研究進展 前言 抗體偶聯藥物(ADC)是由靶向特異性抗原的單克隆抗體與小分子細胞毒性藥物通過連接子鏈接而成,兼具傳統小分子化療的強大殺傷效應及抗體藥物的腫瘤靶向性。ADC 由三個主要部分組成：負責選擇性識別癌細胞表面抗原的抗體，負責殺死癌細胞的藥物有效載荷，以及連接抗體和有效載荷的連接子。ADC 對抗原的識別導致 ADC 通過內吞途徑進入細胞內，通過溶酶體降解后，有效載荷以生物活性形式釋放并發揮作用，導致癌細胞死亡。細胞內有效載荷的數量由每個細胞表面抗原的數量、每個 ADC 的藥物有效載荷分子的數量（也稱為藥物抗體比率，DAR）以及抗原返回細胞表面所

18、需的時間決定。有效載荷可能在癌細胞死亡和降解后逃逸，也可能從胞漿中透膜而出。這種釋放的后果可能是有益的（也稱為旁觀者效應），也可能是有害的，導致全身毒性。ADC 中有幾個變化的部分，成功顯然沒有通用的公式。因此，如何選擇合適的抗體、在何處以及如何將連接子連接到抗體、每個抗體連接多少藥物分子、如何連接連接子和藥物有效載荷、最佳藥物有效載荷是什么樣的？這些問題需要我們深刻理解 ADC 各個組分的生物學和化學特性，才能獲得滿意的答案。微管破壞藥物 金盞花素 Auristatins 是 ADC 中使用的重要有效載荷，最著名的家族成員 MMAE 存在于兩種上市藥物 Adcetris 和 Polivy 中

19、。目前，超過 10 種以金盞花素（如 MMAE）或一甲基金盞花素 F（MMAF）為有效載荷的 ADC 正在進行臨床試驗。7 上圖描述了 auristatine 及其常用的連接位點。金盞花素的構效關系（SAR）已被廣泛研究，主要集中在末端亞單位：P1（N-末端）和 P5（C-末端），最常見的方法是在 P1 上引入氨基甲酸酯功能。2015 年，西雅圖遺傳學的研究人員將 ADC 有效載荷的范圍擴大到包括叔胺，特別是N-二甲基 auristatine，首次通過銨鍵將藥物與單克隆抗體結合。所得 ADCs 在生理條件下穩定，體內外活性高，免疫特異性強。這些結果擴大了 ADC 可用于靶向給藥的藥物種類。最近

20、，Agensys 公司通過調節中心亞基 P2-P3-P4，將疊氮化物基團引入 P2 和 P4 亞基，在與蛋白酶可裂解的連接子偶聯后，產生了在體外和體內效力提高的親水性衍生物，這為連接子的連接提供了新途徑。一般來說，在同時含有胺和醇反應的 auristatin 中，首選的連接點是胺通過氨基甲酸酯鍵偶聯。西雅圖遺傳學開發了一種新的策略，將含醇的有效載荷與亞甲基烷氧基氨基甲酸酯（MAC）偶聯。為了穩定 MAC 鍵，堿性基團和吸電子基團都靠近氨基鍵，結果表明，該偶聯物在生理條件下是穩定的，具有很高的效價，并且在體內外都具有免疫特異性。8 此外，烏普薩拉大學的研究人員還開發了 AZASTATIN，作為一

21、類新的強有力的auristatin 衍生物，包含一個中心胺側鏈的抗體結合位點。他們的研究結果證實，這些auristatin 衍生物是一類新的細胞毒性有效載荷，適合 ADC 開發。美登素衍生物（DM2，DM4）美坦辛是一種非常有效的微管組裝抑制劑，可誘導細胞的有絲分裂停止。但是這種結構很難共軛，因為它沒有反應性官能團，為了克服這個問題，一系列含有 SMe 基團的非常有效的衍生物被創造出來。這一類分子的第一個例子是 DM1 和 DM4，它們帶有甲硫丙?；皇翘烊?N-乙?；?。從有效載荷 DM1 和 DM4 中，通過使用二硫鍵與連接子偶聯。穩定的二硫鍵連接子在血液循環中表現出良好的穩定性，同時在細

22、胞內保持有效的分裂。此外，幾種基于 maytansine 的 ADC 利用相同的二級羥基作為附著點，并在大多數情況下攜帶轉谷氨酰胺酶生物結合的連接子。例如，一種基于 Daratumumab 的 ADC 被證明能向 CD38 過度表達的癌細胞特異性地傳遞 DM4。最近 ImmunoGen 開發了一種新型的ADC，它包含一種含硫的 maytansinoid，通過一種高度穩定的三肽連接體連接到抗體上，附著點與上述羥基相同。與先前的美登素 ADC 相比，增加連接物中亞甲基單元的數量增加了旁觀者殺傷活性，并提高了小鼠體內的療效。在類似的方法中，保持核心大環不變，9 Regeneron 和 Abzena

23、的研究人員研究了 N-甲基丙氨酸氮取代的影響，也改變了大環上側鏈的長度，以及通過伯胺和仲胺連接的連接子。微管溶素 Tubulysins 是微管聚合的有效抑制劑，可導致分裂細胞的細胞骨架迅速解體，并導致細胞凋亡。它們是一個天然存在的四肽家族，含有 Mep、Ile、Tuv 和 Tut，R3=OH 或Tup，R3=H。利用 Tubulysins 作為 ADC 有效載荷，其廣泛的附著點已被充分開發。這種結構中一個明顯的附著點是 Tut 或 Tup 模塊的羧酸，如 Endocyte 的 EC1428，其中羧酸通過酰肼部分連接到連接子。Oncomatryx 公司也采用了同樣的方法，以同樣的方式安裝了可切割

24、的PABAValCit 馬來酰亞胺連接子。阿斯利康、百時美施貴寶和輝瑞使用的另一種方法依賴于 Tup 或 Tut 中苯環的衍生化。10 連接子與 Mep 基團的連接也得到了廣泛的研究。Ingenica 研究人員報告說，去甲基Mep 類似物保留了強大的細胞毒性活性，可被視為有價值的有效載荷，允許在仲胺上引入不可切割的馬來酰亞胺己基連接子。Oncomatryx 的研究表明，當 Mep 被另一個擁有仲胺的基序取代時，通過氨基甲酸酯鍵引入可切割的連接體是產生 ADC 的有效途徑。特別有趣的是，基因泰克關于通過季銨基團將連接子連接到含叔胺的有效載荷上。在有效載荷上引入 mc-Val-Cit-PABA 連

25、接子導致更多親水性結合物并改善了血液中的穩定性。西雅圖遺傳學也采用了同樣的方法，通過過度表達葡萄糖醛酸，葡萄糖醛酸連接子也可以改善親水性和選擇性的細胞內切割通過癌細胞中過表達的-葡萄糖醛酸酶。隱粘菌素 隱粘菌素（Cryptomycins，CR）是一個具有抗腫瘤活性的六元大環二肽家族。已有的臨床試驗的結果表明，在達到治療效果所需的劑量下，其毒性水平是不可接受的。幾個小組嘗試將 CR 用于 ADC，但是由于在 CR 中缺少偶聯位點，目前，有兩種不同的方法通過引入其它基團，使得能夠連接 ADC 的連接子。一種是由基因泰克的研究人員將苯轉化為芐胺以產生有效的有效載荷，這種有效載荷適合通過氨基甲酸酯鍵連

26、接。在第二種方法中，四川大學的研究人員利用了隱霉素-52 的前藥形式（CR55），它可以在生理條 11 件下重新環化為 CR52?？褂薪z分裂 EG5 抑制劑 紡錘體驅動蛋白（KSP，也稱為 Eg5 或 KIF11）是一種 ATP 依賴性運動蛋白，參與細胞周期中心體的分離。因此，用 KSP 抑制劑（KSPis）阻斷有絲分裂中的這一重要事件可產生抗腫瘤效力。拜耳發現了一個新的吡咯亞類的 KSPis，他們研究了該分子不同位置與保持對 KSP 強親和力的連接子的連接兼容性。同樣，諾華的研究人員使用含咪唑的KSP抑制劑作為 Eg5 ADC。利用伯醇或仲酰胺部分，他們安裝了帶有馬來酰亞胺端基的不可裂解連接

27、子。當與靶向 HER2 和 c-KIT 的抗體偶聯時，得到的 ADC 顯示出優于 Kadcyla 的體內療效。DNA 損傷藥物 吡咯苯并氮卓類和吲哚氯苯并氮卓類 12 吡咯并2,1-c1,4苯二氮雜卓（PBD）是一類具有抗腫瘤活性的天然產物。它們的作用方式是在 DNA 的小凹槽中進行選擇性烷基化，其中鳥嘌呤的 N2 與 PBD 上的親電 N10/C11亞胺形成共價鍵。西雅圖遺傳學使用 SGD1882 的苯胺作為附著點，模仿可切割連接子中常用的 PAB 單元，釋放自由的 PBD 有效載荷。StemCentrx 與 Spirogen 合作，利用 PBD 的 N-10 位置連接一個氨基甲酸酯的連接子

28、。同樣的氨基甲酸酯鍵也被 Immunogen 用于結構相似的吲哚氯苯偶氮卓二聚體（IBD）有效載荷。他們還報道了同一類 IBD 的不同方法，其中一個取代的苯環被用作兩個 IBD 單體的 C8/C8位置之間的連接物。以類似的方法，Spirogen 和 Genentech 設計了一種碘苯連接的 PBD，允許在過渡金屬催化反應中引入不同的連接子。通過使用 Sonogashira 偶聯、BuchwaldHartwig 偶聯或疊氮化物-炔烴點擊反應，分別獲得炔烴、哌嗪或三唑連接的連接子有效載荷共軛物。13 杜卡霉素 杜卡霉素是一種強大的細胞毒性物質，通過其高活性的環丙烷環與 DNA 的小凹槽結合，并在

29、N3 位置烷基化腺嘌呤。非環化的，鹵甲基形式的杜卡霉素細胞毒性活性顯著降低。由于分子中苯酚基團可作為內消旋體激活劑，從而形成親電環丙烷，因此杜卡霉素ADC 開發中的連接策略集中于酚官能團的連接子連接。在 Synthon 開發的 SYD985 中，苯酚基團是通過雙氨基甲酸酯連接連接子與 Mc-val-cit-PABC 有效載荷的位置。組織蛋白酶 B 裂解后，游離苯酚促進分子內重排成親電環丙基形式。Medarex 采用了一種不同的方法，通過分子非烷基化部分的芳香胺連接連接子，并用 N-甲基哌嗪氨基甲酸酯部分掩蔽苯酚前藥。在體內，苯酚將被釋放，隨后活性環丙烷將在羧酸酯酶的作用下形成。14 喜樹堿 喜

30、樹堿（CPT）及其衍生物是拓撲異構酶 I 抑制劑的經典例子。它們穩定了拓撲異構酶誘導的 DNA 單鏈斷裂，當三元 DNA-TOP1-抑制劑復合物遇到復制叉時，DNA 發生雙鏈斷裂。天然喜樹堿是一種五環結構，其極低的溶解性阻止了其作為癌癥治療藥物的廣泛應用。其水溶性前藥伊立替康獲得了轉移性結直腸癌的上市許可。SN-38 是伊立新坦的活性代謝物，通過人體肝臟羧酸酯酶的作用在體內生成，其可通過打開內酯環而失活。Immunomedics 建立了兩種不同的策略，通過其羥基部分結合 SN-38。在一個例子中，連接子通過反應性更強的 C-10 苯酚基團連接，從而產生穩定的氨基甲酸酯鍵，而在另一個例子中，通過

31、 C-20 羥基，同時穩定內酯形式，而 C-20 羥基對體內效力至關重要。另一種適合 ADC 的非常有效的藥物是依沙替康（DDX-8951f）。這種喜樹堿類似物在其環己烷環上具有胺取代基，橋接 7 和 9 位。依沙替康的氨基有助于其水溶性，而環己烷環賦予的剛性被認為有利于活性內酯形式與非活性水解羥基酸的平衡。氨基羥基乙?；?DXd（1），而 4-氨基丁?；?DXd（2），這兩種化合物都保留了依沙替康的生物活性。懸垂的羥基和氨基是明顯的附著點，可使用酶可切割的 Gly-Gly-Phe-Gly 四肽連接子連接有效載荷。與抗 HER2 抗體偶聯產生的 ADC 在臨床環境中顯示出對抗 HER2

32、 表達癌癥的巨大潛力。15 DXd 的環己胺環雖然被認為穩定了生物活性內酯形式，但它攜帶了一個手性中心，使合成工作和 SAR 研究復雜化。為了克服這一困難，Immunogen 的研究人員研究了一組新的喜樹堿類似物，這些類似物能夠與單抗偶聯。并且在這里，這個環被打開，額外的手性中心被消除。從一種常見的中間產物開始，研究人員嘗試了三種類型的結構，并隨后使用不同的聚苯胺連接子連接有效載荷。當與抗人表皮生長因子受體（HuEGFR）的抗體偶聯時，產生的 ADC 對 EGFR 陽性的 HSC-2 腫瘤異種移植模型有效?？ㄆ婷顾?卡奇霉素是一類被廣泛研究的烯二炔類抗生素，其結構和作用機制特別有趣和復雜，使其

33、成為 ADC 有效載荷領域的一類抗生素。在ADC中連接calicheamicin的策略以市場上的adc Mylotarg為例，還有Besponsa。有效載荷的釋放分兩步進行：在酸性細胞內環境中對腙進行敏感的裂解，然后通過細胞內谷胱甘肽還原二硫鍵。釋放的硫醇發生分子內 1，4-加成的烯酮觸發伯格曼環化反應，產生一個二自由基。這種活性中間體能夠從脫氧核糖骨架中提取氫原子，產生雙鏈DNA 斷裂，進而導致細胞死亡。16 最近，從不列顛哥倫比亞地衣中發現的鏈霉菌中分離出一種新的烯二炔類天然產物，稱為 uncialamycin。這種結構通過全合成得到證實，從那時起，一些高效的合成類似物被制備成 ADC 的

34、潛在有效載荷。BMS 的研究人員表明，由于在各種肽偶聯條件下反應活性較低，因此，Uncialamycin的仲胺不是一個合適的連接點。研究人員合成了一種類似物，其中一個氨基直接引入到芳香環上，但這種苯胺的反應性也太弱，不能作為連接子引入的基團。另一方面，使用氨基乙基延伸物安裝脂肪族胺，為連接子提供了合適的連接點。從后一個有效載荷中，他們使用蛋白酶可切割的二肽和不可切割的連接子制備前體。CD70-ADC 具有可切割連接體，對腎癌細胞株具有高度特異性的細胞毒活性，而相應的不可切割 ADC 在同一細胞株上不具有活性。最近，為了繼續這項工作，BMS 的研究人員在設計的、高效的、化學穩定的 unciala

35、mycin類似物中使用苯酚基作為附著點。使用新開發的苯酚烷基化，在有效載荷的苯酚基團上添加了一個經典的可裂解連接子。將產生的有效載荷與抗體偶聯，其在體外和體內均顯示抗原特異性抗腫瘤活性。創新藥物 凋亡誘導劑（Bcl-xL 抑制劑）17 抗凋亡 Bcl-2 家族成員（包括 Bcl-xL）的過度表達是癌細胞獲得凋亡抵抗的機制之一。能夠阻斷 Bcl-xL 上 BH3 結合域的藥物可以觸發癌細胞凋亡。2017 年，AbbVie 首次以ADC 的形式展示了 BcL-xL 抑制劑的有效載荷，其靶向表達 EGFR 的特定細胞或組織。有趣的是，研究人員在有效載荷上使用了三個不同的連接點來連接可切割的連接子。氨

36、基烷基延伸的核心修飾用于在需要時建立合適的連接位點。泰蘭司他丁及其類似物 靶向剪接體是一種參與 mRNA 加工的大型核糖核蛋白復合物，為靶向癌癥治療提供了一種有希望的治療選擇。有幾種天然產物能夠通過與不同的剪接體亞單位結合來抑 制 RNA 剪 接。最 具 代 表 性 的 是thailanstatin A，它可以與剪接體的 SF3b亞單位結合，從而阻止 RNA 剪接。Thailanstatin A 缺乏一個適合連接連接子的基團。為了解決這個問題，將羧酸與乙二胺偶聯以引入含有胺的間隔基，該間隔基通常用于連接子的安裝。18 將這種天然產物用于 ADC 的另一個困難是存在多種反應性功能。例如，中心核中

37、的二烯可以通過 DielsAlder 反應與用于生物結合的馬來酰亞胺部分反應。這個問題是通過使用另一個共軛部分，鹵代乙酰胺來解決的。結合這兩種修飾并包含可切割連接子的 ADC 首次在專利文獻中報道，并且聲稱它們在幾個表達 HER2 的細胞系中具有適度的活性。最近，輝瑞報告說，羧酸直接與抗體的有效表面賴氨酸（無連接子偶聯）結合導致迄今為止最有效的 Thailanstatin ADC。這些賴氨酸偶聯物的活性與藥物負載有關，而其他有效載荷類通常沒有觀察到這種特性。ADCs 在胃癌異種移植模型中顯示出良好的作用。鵝膏毒素 在 ADC 技術領域，使用類似 amatoxins 的轉錄抑制劑是一種相對較新的

38、方法。九種天然存在的 amatoxin 衍生物具有相同的骨架結構，一個由八個 L-構型氨基酸組成的大環，通過亞砜部分連接在色氨酸和半胱氨酸殘基之間。amatoxins 的三個側鏈是羥基化的，OH 基團具有良好的水溶性并與目標分子結合。兩種肽，-鵝膏糖蛋白和-鵝膏毒素，占所有毒素的 90%。在amatoxins上共使用過三個附著點產生 ADC。第一次嘗試是將-鵝膏毒素的羧基偶聯到IgG 上賴氨酸的氨基，這種連接具有良好的血漿穩定性和高細胞毒性，但這種生物偶聯的產率很低。二氫異亮氨酸的羥基也被認為是一個連接點，引入谷胱甘肽作為連接子，然后通過賴氨酸結合，可獲得體外細胞毒性和體內抗腫瘤活性優異的 A

39、DC，但不幸的是，由于血清羧酸酯酶裂解連接子，導致其循環穩定性差。第三種方法，附著于色氨酸的 6-羥基代表了目前的標準程序，苯酚與各種連接子的醚化導致了高度穩定和有效的ADC。由于鵝膏毒素其它氨基酸要么不具化學活性，要么是與 RNA 聚合酶 II 結合的關鍵，因此不能將其它的19 鵝膏毒素氨基酸（即羥脯氨酸、甘氨酸、異亮氨酸和半胱氨酸）用于偶聯。于 amanitin 的代表性的 ADC 為 HDP-101。有效載荷本身是一種合成的金剛烷醇衍生物，優化了穩定性。與天然天麻素相比，兩個差異是色氨酸中沒有 6-OH，硫醚鏈取代亞砜。通過天冬氨酸側鏈上酰胺的形成，引入組織蛋白酶 B-裂解連接子。最近，

40、Park 及其合作者為含苯酚的有效載荷設計了一種新的連接基序（OHPAS）。它是一種二芳基硫酸鹽，一個芳基部分來自有效載荷，另一個來自連接基序的潛在苯酚基團。將該技術應用于曲妥珠單抗 ADC 中的 a-鵝膏毒素，在體外和體內表現出強大的細胞毒性。煙酰胺磷酸核糖轉移酶 煙酰胺磷酸核糖基轉移酶（NAMPT）是一種負責將煙酰胺轉化為煙酰胺單核苷酸的酶，其抑制劑在各種臨床前和臨床研究中顯示出有效性，但其臨床應用受到靶向毒性和劑量限制性毒性的限制，如血小板減少和胃腸道不良反應。諾華公司的研究人員在 NAMPT 抑制劑有效載荷中的苯環對位中引入哌嗪部分，確定了合適的連接子附著點。這種分子在 c-Kit 和

41、HER2 表達細胞系上表現出納摩爾水平的效力，并且耐受性良好，在體內表現出靶向依賴性?？R霉素 從庫拉索菌中分離得到兩種新的蛋白酶抑制劑，卡馬霉素 A 和卡馬霉素 B。兩者都具有亮氨酸衍生的,-環氧酮彈頭直接連接到甲硫氨酸亞砜或甲硫氨酸砜。他們被發現能抑制釀酒酵母 20S 蛋白酶5 亞單位活性（糜蛋白酶樣活性）。此外，它們對肺癌和結腸癌細胞株具有很強的細胞毒性。然而，由于它們的高效價，它們的選擇性較差，經常表現出毒副作用。因此，劇毒的卡馬霉素衍生物適合作為 ADC 的彈頭，可以保持所需的效力，并獲得更好的耐受性。所設計20 的類似物均在 P2 位置并入砜甲硫氨酸衍生物（如卡馬霉素 B），而不是

42、卡馬霉素 A中的亞砜甲硫氨酸，因為這消除了亞砜基立體異構體混合物產生的結構復雜性。第一代類似物在 P4 末端含有胺基，不幸的是，這個附著點并不合適，因為有效載荷顯示細胞毒性活性降低。第二代卡馬霉素類似物在 P2 側鏈上含有一個胺基，當短乙基氨基鏈延伸磺?；鶗r，效果最好。在第三代類似物中，芳基連接砜和胺，因此降低了它的堿性。第二代和第三代有效載荷都顯示出強大的體外活性，并用可切割或不可切割的連接子連接。不幸的是，沒有一種 ADC 對受試癌細胞系表現出比曲妥珠單抗更高的細胞殺傷能力。參考文獻：1.The Chemistry Behind ADCs.Pharmaceuticals(Basel).20

43、21 May;14(5):442.21 ADC 連接子的研究進展 前言 由于有效載荷、連接子和偶聯方法的改進，抗體偶聯藥物（ADC）的發展在過去十年中取得了顯著進展。特別是，連接子設計在調節 ADC 在體循環中的穩定性和腫瘤中的有效載荷釋放效率方面起著關鍵作用，從而影響 ADC 的藥代動力學（PK）、療效和毒性特征。一些關鍵的連接子參數，如偶聯化學、連接子長度和連接子空間位阻都會對 ADC 藥物的 PK 和功效產生影響。理想的連接子應在循環系統中保持穩定，并在腫瘤中釋放細胞毒性有效載荷。然而，現有的連接子通常會非特定地釋放有效載荷，并不可避免地導致脫靶毒性。因此，在 ADC 藥物的設計中，正確

44、調整連接子的這些重要參數，從而實現 ADC 穩定性和有效載荷釋放效率之間的平衡，才能達到 ADC 藥物預期的效果。在過去幾年中，人們開發了許多新的連接子，包括組織蛋白酶可切割連接子、酸可切割連接子、GSH 可切割連接子、Fe(II)可切割連接子、新型酶可切割連接子、光響應可切割連接子和生物正交可切割連接子。其中，組織蛋白酶、GSH 和酸可切割連接子已被充分研究并應用于經批準的 ADC 中。連接子設計取得了許多重要進展，這些工作將有助于指明連接子未來的發展方向。組織蛋白酶可切割連接子 2017 年，Caculitan 等人發現纈氨酸瓜氨酸（Val-Cit）連接子對多種組織蛋白酶表現出廣泛的敏感性

45、，包括組織蛋白酶 B、組織蛋白酶 K、組織蛋白酶 L 等。為了提高選擇性，Wei等人設計了一種使用環丁烷-1,1-二甲酰胺（cBu）結構的連接子，該結構主要依賴于組織蛋白酶 B。在細胞內，組織蛋白酶 B 抑制劑能夠有效地抑制（超過 75%）含 cBu-Cit連接子的藥物釋放，而組織蛋白酶 K 抑制劑沒有顯著的效果。相反，傳統的含Val-Cit 的連接子似乎對所有單一蛋白酶抑制劑耐受（組織蛋白酶 B、L 和 K 的22 抑制劑均小于 15%）。同時，與含有 Val-Cit 連接子的 ADC 相比，含有 cBu-Cit 連接子的 ADC在體外表現出更大的腫瘤抑制作用。此外，肽連接子的優化不僅限于開

46、發新的結構，肽連接子可以通過最小的結構變化進行優化，如氨基酸的類型和結構化學。一些研究將 Val-Cit 和 Val-Ala 二肽結構與 MMAE 的有效載荷連接進行了比較。在非內化抗體的情況下，結合到工程化半胱氨酸的 Val-Cit 和 Val-Ala 連接子都表現出類似的特征，并且比 Val-Lys 和 Val-Arg 類似物表現出更好的性能。在使用隨機半胱氨酸結合的抗 Her2 ADC 的情況下，與 Val-Cit 相比，Val-Ala 在高 DAR 結構中顯示出較少的聚集性。另一方面，兩種連接子顯示出相似的緩沖穩定性、組織蛋白酶 B 釋放效率、細胞活性和組織病理學特征。四肽 Gly-G

47、ly-Phe-Gly 顯示出穩定和有效的可切割連接子的所有特性，已上市的 ADC藥物 Enhertu 使用了此類連接子。第一三共的 Enhertu 是一種血漿穩定的 ADC，DAR 為7.7，在溶酶體中發生蛋白酶降解，釋放 DX-8951f，這是一種有效的拓撲異構酶 I 抑制劑，來源于 exatecan。由于連接子不含增溶劑，達到如此高的 DAR 是非?？捎^的，因為它與廣泛確立的原理相矛盾，即高 DAR 結合物可能具有較差的藥代動力學特征。這里使用的自降解間隔子是簡單和緊湊的半胺化，而不是 Val-Cit 連接子使用的 PABC。酸可切割連接子 酸切割連接子利用腫瘤組織（4.05.0）和血漿之

48、間的 pH 差(7.4）選擇性地向腫瘤組織釋放有效載荷。這種策略在 Mylotarg 獲得了最早的臨床成功，后來也在 Besponsa 中得到應用。然而，酸切割連接子的穩定性不足嚴重限制了其在 ADC 中的應用，苯酮衍生的腙連接子在人和小鼠血漿中以 2 天的半衰期水解，Sacituzumab-govitecan（Trodelvy）的血清穩定性也不令人滿意，其半衰期為 36 小時。因此，酸裂解ADC 需要更穩定的連接子，或者只能使用中度細胞毒性的有效載荷。2019 年，一種新型的硅醚基酸裂解 ADC 被開發出來，攜帶高細胞毒性的單甲基 auristatin E（MMAE）。這種設計極大地提高了酸

49、裂解連接子的穩定性，此外，這種使用新型硅醚連接子的 ADC 在人血漿中的半衰期超過 7 天，并且在小鼠異種移植模型23 中顯示出良好的治療效果。GSH 可切割連接子 與血漿(5mol/L）中相比，GSH 切割的連接子依賴于細胞質中較高水平的谷胱甘肽（110 mmol/L）。二硫鍵在這些連接子中最常用，然而，目前的二硫鍵結構無法實現高循環穩定性和高效細胞內釋放的完美結合。2017 年，Thomas 等人試圖通過將小分子藥物直接連接到硫單抗中的工程化半胱氨酸來解決這個問題。通過直接連接抗體，抗體的空間保護將提高循環穩定性。體內穩定性研究表明，當 DM1 通過二硫鍵連接到單抗的 K149C 上時，超

50、過 50%的藥物即使在七天后仍保持連接。體內藥效研究表明，在人類淋巴瘤-腫瘤異種移植小鼠模型中，這種新型抗 CD22-DM1-ADC 可誘導腫瘤消退。同年，這種新策略被用于 PBD 作為有效載荷的 ADC。與馬來酰亞胺肽（Val-Cit）-PBD-ADC 相比，在人類非霍奇金淋巴瘤異種移植小鼠模型中，新型二硫鍵的 ADC 表現出類似的活性。同時，這種新型二硫鍵 ADC 的 MTD 高于 Val-Cit ADC（10 vs2.5 mg/kg）。Fe(II)可切割連接子 鐵代謝異?？商岣哂坞x亞鐵的水平，基于這一策略，增加未結合的亞鐵濃度已用于前藥設計。2018 年，Spangler 等人報告了一種

51、 Fe(II)反應性 1,2,4-三氧烷骨架的（TRX）連接子，并將這種連接子用于 ADC。24 通過 TRX 和 Fe(II)的 OO 鍵之間的 Fenton 反應裂解連接子，提供羰基中間體并通過-消除釋放有效載荷。在體外細胞毒性研究中，含有 TRX 連接子的 ADC 在抗原陽性細胞中的活性與含有 Val-Cit 連接子的經典 ADC 相似。然而，在抗原陰性的 MDA-MB-468 細胞系中，含有 TRX 連接子的 ADC 仍然顯示出顯著的毒性。這種不穩定性是由金剛烷部分和抗體上附近位點之間的非特異性相互作用引起的。新型的酶可切割連接子 與組織蛋白酶一樣，焦磷酸酶和磷酸酶也是在溶酶體中選擇性

52、表達的水解酶。2016年，默克公司的研究人員設計了含有磷酸和焦磷酸的連接子與組織蛋白酶 B 敏感的 Val-Cit-PABA 搭配，旨在傳遞糖皮質激素。這種親水性和永久性帶電基團的優點是溶解性，不僅能夠與親脂性糖皮質激素衍生物進行生物偶聯，而且促進 ADC 純化，ADC 中的殘余連接子少于 0.10%。含有磷酸和焦磷酸的 ADC 在體外都具有活性。默克公司的同一組研究人員還開發了一種獨特的基于焦磷酸酶的連接子，用于釋放含羥基有效載荷地塞米松和丙酸氟替卡松。兩種 ADC 在體外均表現出良好的穩定性，對腫瘤細胞系具有較強的活性。除了 2006 年為 ADC 開發的經典-葡萄糖醛酸酶可切割連接子外，

53、還發現-半乳糖苷酶在腫瘤細胞中過度表達并具有水解活性。最近報道了一種使用-半乳糖苷酶裂解連接子的 ADC，其中包含 PEG10 間隔子。間隔子被硝基取代，以提高自降解速率。類比-葡萄糖醛酸酶連接子，其解離機制涉及水解-半乳糖苷酶部分，它賦予化學前體親水性。另一個優勢是-半乳糖苷酶僅存在于溶酶體中，而-葡萄糖醛酸酶在溶酶體中表達，也在實體瘤的微環境中表達。研究證明，在抗 HER2-ADCs 釋放 MMAE 的背景下，含-半乳糖苷酶連25 接子的 ADC 在體外和體內均比 T-DM1 更為有效。最近，還出現了硫酸酯酶裂解的連接子，硫酸酯酶在幾種癌癥類型中過度表達，表現出潛在的選擇性。研究涉及以 M

54、MAE 為有效載荷的抗 Her2 抗體，與經典的可切割 Val-Cit和 Val-Ala 連接子相比，硫酸酯酶連接子對 Her2+細胞系顯示出相似的效力。光響應可切割連接子 近年來，基于光響應切割的有效載荷釋放策略逐漸出現。光響應可切割具有以下優點，包括低毒性、快速反應、高靈敏度和特異性。2015 年，Nani 等人首次對ADC 采用近紅外（NIR）光照鎖定策略。光響應切割基于七甲川菁熒光團骨架。在用NIR光（=650900nm）照射后，ADC 以位點特異性方式在受照腫瘤區域有效釋放小分子細胞毒素 CA-4。在體外細胞毒性實驗中，含有 NIR 光裂解連接子的 ADC 在EGFR+細胞系中經輻射

55、后表現出相當于 CA-4 的活性，而未經輻射時表現出低活性。然而，這種連接子的自聚集和光不穩定特性限制了其作為藥物的進一步開發應用。最近，有研究報告了一種新型的紫外（UV）光控 ADC。連接子引入了紫外光控制的鄰硝基芐基作為切割觸發。在穩定性和釋放研究中，這種含有 MMAE 的連接子在自然光下 6天內釋放1%，在輻照后 10 分鐘內顯示 MMAE 的快速釋放，并達到最高平臺。在體外細胞26 毒性實驗中，用 365nm（40W）紫外光照射后，含有鄰硝基芐基連接子的ADC 的活性顯著增加，比未經照射的ADC 高 50 倍。2019 年，報道了一種光響應、自斷裂的連接子，使用光籠 C40 氧化堿性位

56、點（PC4AP）。與前面提到的兩個ADC 相比，這種連接子在設計上具有“雙重保險”。在 365 nm 輻射下，PC4AP 的羥基與其自身抗體上附近的胺發生分子內加成反應，隨后的消除反應導致裂解和有效載荷釋放。含有肽-PC4AP-DOX的 ADC 在陽性細胞中顯示出與有效載荷 DOX 相當的毒性，并且在沒有輻射的情況下沒有細胞毒性。生物正交可切割連接子 生物正交化學具有選擇性高、加工快速簡便、副產物無毒等特點。2019 年，Wang 等人開發了一種生物正交可切割連接子，該連接器使用了經典的生物正交切割對 Cu(I)-BTTAA 和 dsProc。然而，生物正交可切割連接子目前主要集中在體外探索上

57、。在反應效率、反應速率、底物穩定性、生物相容性和操作方便性方面仍存在問題，離臨床應用還很遠。27 小結 在過去的幾年里，ADC 的結構優化和機制擴展方面取得了許多進展。新的可切割連接子已經被開發出來，以獲得對腫瘤的更高選擇性。尤其新型光響應可切割連接子和生物正交可切割連接子可以打破傳統 ADC 的細胞內藥物釋放限制。這些新型連接子的初步數據令人鼓舞，未來將極大地促進 ADC 藥物的迅猛發展。參考文獻：1.The Chemistry Behind ADCs.Pharmaceuticals(Basel).2021 May;14(5):442.2.Antibody-drugconjugates:Re

58、cent advances in linker chemistry.Acta Pharm Sin B.2021Dec;11(12):3889-3907.28 ADC 生物偶聯技術的研究進展 前言 臨床成功的 ADCs 的設計不僅取決于有效載荷的效力及其附著點、連接子的穩定性和有效的藥物釋放，而且還取決于抗體和生物偶聯技術的選擇。在過去 10 年中，所有經 FDA 批準的 ADC 都是以 ADC 的異構混合物的形式存在，單抗的不同位置上附著著不同數量的藥物。偶聯位點對 ADC 穩定性及其藥代動力學具有顯著的影響，高 DAR（藥物抗體比）常常導致血漿清除迅速，而低 DAR 的 ADC 則表現出的活

59、性較弱。在 ADC 的藥物中，裸單抗的存在是一種有效的競爭抑制劑。因此，在過去十年中，人們開發了一大批新的偶聯策略，目的是控制小分子藥物的位置和數量，同時保持結構完整性和同質性?；诨瘜W的特異性原位抗體修飾 單克隆抗體的天然結構為生物偶聯提供了多種可能性，基于化學的、特異性的天然（非工程）抗體偶聯具有一些優點。它可以避免抗體特定位點突變的復雜性，以及在細胞培養的放大和優化方面可能面臨的挑戰。偶聯位點根據抗體序列，賴氨酸、組氨酸、酪氨酸和半胱氨酸等內源性氨基酸在二硫鍵間的連接位點非常具有吸引力。所有經 FDA 批準的 ADC，直到 2021 年，都利用這些內源性氨基酸進行偶聯。然而，抗體支架還包

60、含聚糖，這是在單克隆抗體生產過程中，FC 區域的翻譯后修飾所導致的。一些研究報告了糖工程化的新策略，這似乎是一種有趣的生物偶聯替代方法。與內源性氨基酸的偶聯 最常見的偶聯方法之一是利用抗體的賴氨酸殘基，氨基酸親核 NH2 基團與利克有效載荷上親電的 N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）基團發生反應。盡管反應簡單，但可利用賴氨酸殘基的高豐度導致了許多 ADC 在隨機分布下的不均勻混合物的形成。DAR 受藥物/抗體化學計量比的控制，該方法得到廣泛應用，包括已獲批的 ADC，如 Besponsa,Mylotarg,和 Kadcyla。最近，同樣也報道了對賴氨酸位點和殘基的特異性修飾。通過計算機輔助設計，磺酰

61、丙烯酸酯被用作中間試劑，用于在天然蛋白質序列上對單個賴氨酸殘基進行修飾。反應的區域選擇性歸咎于磺酰丙烯酸酯的設計以及每個賴氨酸周圍獨特的局部微環境。通過計算預測，pKa 最低的賴氨酸容易以位點特異性的方式在弱堿性 pH 下優先反應。即使在其他親核殘基如半胱氨酸存在的情況下也觀察到了這種反應。該技術已應用于 5 種不同的蛋白質和曲妥珠單抗，在偶聯后均保留了原有的二級結構和蛋白質功能。2018 年，Rai 等人報告了另一種利用“化學關鍵蛋白”的可逆分子間反應進行的位點特異性修飾。該試劑攜帶多種官能團，這些官能團在所有可獲得的賴氨酸殘基上可逆地形成29 亞胺部分。然后，關鍵蛋白通過試劑中的環氧化物與

62、近端組氨酸殘基反應。因此，在生理條件下，關鍵蛋白從賴氨酸中分離，醛被再生，從而能夠通過肟結合標記抗體。這種關鍵蛋白的定向修飾技術后來發展成單賴氨酸殘基標記技術，即使在存在 N-末端胺的情況下也具有毋庸置疑的選擇性。方法的成功依賴于 Fk1-間隔子-Fk2試劑。Fk1官能團與賴氨酸可逆反應，調節 Fk2近端賴氨酸部分的微環境。然后通過酰胺鍵在 Fk2處的賴氨酸殘基（K169 和 K395）進行偶聯，間隔子的設計調節偶聯的位置。該方法已成功應用于 ADC（trastuzumab-emtansine）的合成，證明其細胞活性與已獲批準的 Kadcyla 相當。Merlul 等人最近報道了一種不同的結合

63、策略，有效地靶向天然抗體上的組氨酸殘基。他們引入了一種基于陽離子有機金屬鉑（II）的連接子，乙二胺鉑（II）2+，圖中表示為 Lx。30 這種技術基于絡合和偶聯兩個步驟。氮雜環配體如哌啶與 Lx 配位形成絡合物前體，穩定的中間體包含有效載荷和配體上的一個氯離子。該復合物含有帶正電荷的 Pt（II）中心，這提高了連接子和有效載荷復合物的水溶性并最小化抗體聚集，該方法還擴展到類似的碘絡合物。在最近的一份報告中，碘化鈉的使用被證明可以顯著提高該技術的偶聯產率和選擇性。Cl-Lx-藥物載荷絡合物上殘留的氯配基與碘化物的交換生成更具活性的 I-Lx-藥物載荷，從而獲得更高的偶聯產率。這項技術已被應用于

64、ADC 藥物的大規模生產。二硫化物重橋接策略 IgG 抗體包含四個鏈間二硫鍵，兩個連接輕鏈和重鏈，兩個位于連接兩條重鏈的鉸鏈區，它們維持著單克隆抗體的完整性。另一個經典的生物偶聯途徑探索了這些半胱氨酸作為有效載荷連接點的作用。四個二硫鍵的還原通常會產生八個巰基，它們能夠與馬來酰亞胺的連接子反應，從而產生 DAR 為 8 的 ADC。Doronina 及其同事報告了嵌合抗 CD30 單克隆抗體偶聯 MMAE，DAR=8 的 ADC 實例。與經典的賴氨酸偶聯相比，這種有效載荷加載方式得到了更好的控制。然而，據報道，較高的藥物負荷會增加聚集的風險，從而導致高血漿清除率，并降低體內療效。Badescu

65、 和 al 在 2014 年報告了一種新的位點特異性重橋接偶聯策略，他們是第一個證明新的雙砜（bis-sulfone）能夠烷基化來自抗體和抗體片段中還原二硫鍵的兩個巰基，對抗原結合的影響最小。后來，Wang 和 al描述了一種新的水溶性烯丙砜（allyl sulfone），該試劑在沒有原位活化的情況下提高了反應活性。它表現出高穩定性、高水溶性和位點特異性。此外，還有巰基炔與末端炔烴和環辛炔生物偶聯的再橋接技術，其進一步發展出新一代馬來酰亞胺，如二溴-（DBM）和二硫代馬來酰亞胺（DTM），用于位點特異性偶聯。這些馬來酰亞胺類似物在第 3 位和第 4 位含有良好的脫離基團，從而實現快速、高效和高

66、產率的偶聯。最近報道了結合二溴和二硫代馬來酰亞胺性質的雜化硫代溴馬來酰亞胺（TBM），這種 TBM 試劑結合更快，顯示出更高的 DAR=4 的百分比，這可能是由于溴減31 少了空間位阻。2015 年，Chudasama 等 人 引 入 了 一 類 新 的 重 橋 接 試 劑，二 溴 吡 啶 二 酮（dibromopyridazinediones）。他們證明了它能有效地插入到二硫鍵中，得到的結構即使在高溫下也表現出了極好的水解穩定性。然而，隨著還原步驟上的溫度升高，也觀察到不均一性，這種結構也允許選擇性地引入不同的功能基團。二乙烯基嘧啶（Divinylpyrimidine）是另一種有效的重橋接試

67、劑，能夠產生穩定的 DAR=4的 ADC。Spring 等人研究了乙烯基雜芳基支架對半胱氨酸再橋接的作用，他們認為用嘧啶取代吡啶可以使雜芳環成為更好的電子受體，從而提高交聯效率。他們的工作擴展到二乙烯基三嗪，在高溫下，重橋接顯示出更高的效率。為了避免與經典馬來酰亞胺偶聯相關的體內不穩定性的缺點，Barbas 等人研究了甲基磺?；交鶒憾?，該試劑對半胱氨酸具有特異性反應。與血漿中的半胱氨酸-馬來酰亞胺偶聯物相比，他們的穩定性更高。受此啟發，Zeglis 設計了 DiPODS 試劑，該試劑含有兩個通過苯基連接的惡二唑基甲基砜部分，DiPODS以重橋接的方式與兩個硫酸根形成共價鍵。與馬來酰亞胺偶聯

68、相比，以這種方式偶聯具有優越的體外穩定性和體內性能。聚糖偶聯 由于 IgG 是一種糖蛋白，它在 Fc 片段每個重鏈的 CH2 結構域 N297 位置包含一個 N-聚糖，這種糖基化可以作為連接有效載荷的附著點。多糖與 Fab 區域間遠距離定位降低了在偶聯后損害抗體的抗原結合能力的風險，此外，與抗體的肽鏈相比，它們的化學組成不同，允許位點特異性修飾，使它們成為合適的偶聯位點。聚糖生物偶聯可根據用于靶向碳水化合物的技術來區分：包括聚糖代謝工程化、聚糖氧化后的糖轉移酶處理、內糖苷酶和轉移酶處理后的酮或疊氮化物標記。Neri 等人報道了在 IgG 抗體的 N-糖基化位點處巖藻糖的位點特異性修飾。這種糖含

69、有一個順式二醇部分，適合選擇性氧化。他們用偏高碘酸鈉氧化巖藻糖殘基，生成一個能夠與含聯氨的連接子反應的醛基，這樣，抗體通過腙鍵與藥物相連。Senter 及其同事向細胞培養基中添加硫基類似物，通過代謝將 6-硫代巖藻糖帶入抗體修飾。他們認為，取代是通過劫持巖藻糖基化途徑來完成的，這樣就引入了化學位點來實現位點特異性結合。與經典半胱氨酸偶聯物相比，這種方法顯著降低了異質性水平，并產生具有更可預測的藥動學和藥效學特性的偶聯物。32 重組 IgG 中很少含有唾液酸，然而，已經證明，利用半乳糖基和唾液酸轉移酶可以酶法改造甘氨酸。通過酶反應添加半乳糖以獲得 G2 聚糖，然后添加末端唾液酸。這種修飾通過高碘

70、酸氧化生成醛基，可以偶聯帶羥胺基團的連接子-有效載荷。所得的偶聯物具有較高的靶向選擇性，體內抗腫瘤活性良好。高碘酸還可氧化蛋氨酸等敏感氨基酸，影響與 FcRn 的結合。除這些偶聯策略外，半乳糖殘基也可以作為修飾位點。多項研究報告了通過使用突變的-1，4-半乳糖轉移酶，將半乳糖替換為一種含酮或疊氮官能團的半乳糖，這種具有雙正交官能團的半乳糖衍生物為高效偶聯開辟了途徑。這些技術已被開發用于成像和抗癌應用。從化膿性鏈球菌中發現的內糖苷酶 EndoS 和 EndoS2，這些酶能夠水解 IgG 的 N-聚糖，從而使水解后的殘基成為生物偶聯的有效位點。這種方法有助于使單抗的聚糖結構均勻化，同時它也適用于任

71、何 IgG 亞型。此類方法應用于 trastuzumab-maytansine，制備出具有良好體外和體內藥效的糖偶聯 ADC。工程化抗體的位點特異性生物偶聯 生物正交化學和蛋白質工程領域的進展有助于產生更均勻的 ADC。盡管在天然單抗上有許多可用的附著方法可供選擇，但在工程化抗體上的位點特異性生物偶聯能夠更有效地控制 DAR，并且避免改變與抗原結合的親和力。這樣，在某些位置加入天然或非天然氨基酸，得到具有優良藥代動力學和藥效學特征的同質產品。酶法 有效載荷的附著可以通過在抗體序列中插入特定的氨基酸標簽以非常有選擇性的方式實現。這些標簽被特定的酶所識別，例如甲酰甘氨酸生成酶（FGE）、微生物谷氨

72、酰胺轉胺酶（MTG）、轉肽酶或酪氨酸酶，從而能夠執行位點特異性偶聯。Aaron 等人探索了一種新的利用醛標記蛋白質的位點特異性偶聯。該技術利用了基因編碼的五肽序列（Cys-X-Pro-X-Arg），其中半胱氨酸殘基被 FGE 識別，并在細胞中蛋白質表達期間被共翻譯氧化為甲酰甘氨酸。這樣，工程化抗體通過 HIPS（hydrazino-PictetSpengler）化學方法與醛特異性連接子選擇性偶聯。微生物轉谷氨酰胺酶（MTGase）策略也經常被開發用于定位特異性偶聯。MTGase 催33 化在脫糖抗體 295 位置的谷氨酰胺側鏈與底物的伯胺之間形成肽鍵。與其他酶策略相比，MTG 是一種靈活的技術

73、，不需要肽供體來實現偶聯。只要?；荏w含有一種伯胺，就沒有結構限制。谷氨酰胺殘基自然存在于單抗的每個重鏈的 Fc 區域。在 295 位去糖基化后，谷氨酰胺殘基通過 MTGase 介導的反應偶聯，可以產生均一的 DAR=2 的 ADC。為了提高效率，可以偶聯帶支鏈的連接子，從而使 DAR 翻倍，297 位的天冬酰胺突變為谷氨酰胺也可增加 DAR。NBE Therapeutics 開發了基于 S 金黃色葡萄球菌轉肽酶A 介導的偶聯。他們的策略利用轉肽酶 A（SrtA），在 LPXTG（X=任何氨基酸）五肽的基序中切割蘇氨酸和甘氨酸殘基之間的酰胺鍵。然后，它催化甘氨酸相關的有效載荷與新生成的 C-末

74、端的偶聯，在生理溫度和 pH 下生成肽鍵。該方法應用于不同抗體，如抗 CD30 和抗 Her2，并使用含有 5 甘氨酸標記的連接子偶聯 maytansine 和 MMAE，兩種 ADC 均顯示出與經典偶聯相似的體外細胞殺傷活性。酶法產生的 trastuzumab-maytansine 在體內試驗中完全匹配 Kadcyla。在另一個例子中，利用轉肽酶法生成了高效蒽環素毒素衍生物 PNU-159682 的 ADC。有趣的是，通過這項技術，偶聯效率甚至高于 Adcetris 和 Kadcyla 類似物。此外，所制備的PNU-159682 ADC 具有較高的體外和體內穩定性，并且顯示出的效力超過了含有

75、微管蛋白靶向有效載荷的 ADC。另一個新興的新方法是通過酪氨酸標簽進行位點特異性抗體標記，酪氨酸標簽與單克隆抗體輕鏈的 C 末端基因融合?？紤]到位點可及性，Bruins 及其同事使用了一種工程化的34 四甘氨酰酪氨酸殘基作為標記，它為偶聯提供了一個容易觸及的位點。酪氨酸酶將酪氨酸氧化成 1,2-醌，從而允許與各種雙環6.1.0壬炔（BCN）衍生物的環加成反應。這種方法可以與含有 BCN 連接子的 MMAE 有效地偶聯。半胱氨酸工程：硫單抗技術 隨機半胱氨酸偶聯和重橋接是利用抗體結構內天然存在的半胱氨酸殘基的技術。然而，隨機半胱氨酸方法的異質性以及重橋接策略中的單抗片段化需要在 ADC 合成中加

76、以考慮，特別是當疏水性藥物被偶聯時。與它們不同的是，硫單抗技術通過利用不涉及結構二硫鍵的工程化反應性半胱氨酸，在抗體上實現所需位點的選擇性和均勻修飾。一般來說，半胱氨酸突變的設計是為了促進細胞毒性有效載荷偶聯的同時，保持單克隆抗體的穩定性、親和力和最小化 ADC 聚集。為了確定突變的最佳位置，通常采用幾種技術，包括計算建模、模型系統篩選和高通量掃描。Junutula 等人首先報道了一種硫單抗策略，用工程化半胱氨酸殘基取代了抗 MUC16 抗體重鏈 114 位的丙氨酸（HC-A114），工程化位置內的反應性硫醇能夠與馬來酰亞胺負載的連接子反應。合成的抗 MUC16 ADC 在異種移植小鼠模型中表

77、現出效力，在大鼠和食蟹猴中表現出高劑量耐受性，這個發現建立了硫單抗偶聯策略的一般性方法。此外，琥珀酰亞胺連接在胞漿內可以經歷兩個平行反應：反向 Michael 反應導致連接子-有效載荷的損失，以及琥珀酰亞胺的水解，這兩種反應都對體內 ADC 活性有顯著影響。為了提高穩定性，Lyon 和合作者設計了一個與馬來酰亞胺相鄰的堿性氨基整合進來的連接子。在連接子中加入二氨基丙酸（DPR）促進了硫琥珀酰亞胺在中性 pH 和室溫下的快速定量水解，這樣，非特異性的去偶聯作用被阻止，從而提高了體內的穩定性。除了常用的馬來酰亞胺外，還探索了不同的半胱氨酸反應劑，如碘乙酰胺、溴甲酰胺、羰基丙烯酸酯，N-烷基乙烯基吡

78、啶鹽。與工程化非天然氨基酸的生物偶聯 除了硫單抗技術外，非標準氨基酸（ncAA）的加入為位點特異性偶聯提供了另一種可能性。該技術使用含有獨特化學結構的氨基酸，從而能夠以化學選擇性的方式引入連接子-有效載荷復合物。該技術需要對抗體序列重組，利用與宿主細胞內所有內源性 tRNAs 和合成酶正交的 tRNA 和氨基酰 tRNA 合成酶（aaRS），用于響應未賦值密碼子將 ncAA 帶入蛋白質。通常，ncAA 在發酵過程中被添加到培養基中。選擇非天然氨基酸是很重要的，因為它們可能激發免疫原性。常用的 ncAA 是具有獨特基團的天然氨基酸的類似物，如酮、疊氮、環丙烯或二烯。35 已有研究將對乙酰苯丙氨酸

79、（pAcF）成功地整合入抗 CXCR4 抗體中。有效載荷 Auristin通過肟連接與抗體有效偶聯，從而生成化學均一的 ADC。該 ADC 在小鼠體內表現出良好的體外活性和完全清除肺腫瘤的作用。由于肟連接所需的酸性條件和 ADC 緩慢釋放的動力學，另一種選擇是加入含 ncAA 的疊氮化物。廣泛應用的對疊氮哌苯胺（pAzF）可在生理條件下快速進行 CuAAC 或 SPAAC 反應，利用這種策略成功地在抗 CD74 抗體上偶聯糖皮質激素有效載荷。除了 pAcF 技術外，還成功地將含疊氮的賴氨酸類似物（AzK）帶入到抗體中，以產生具有 Auristin、PBD 二聚體或微管蛋白有效載荷的位點特異性

80、ADC。此外，賴氨酸的環丙烯衍生物（CypK）以及自然發生的非典型氨基酸，如硒代半胱氨酸（Sec）都成功地整合進入抗體中。所產生的 ADC 表現出良好的穩定性、選擇性以及體外和體內活性。小結 在過去的幾年里，ADC 的結構優化和機制擴展方面取得了許多進展。新的偶聯技術已經被開發出來，以獲得對腫瘤的更高選擇性。這些偶聯技術使 ADC 具有更好的穩定性、選擇性以及體外和體內活性。這些新型偶聯技術的初步數據令人鼓舞，未來將極大地促進 ADC藥物的迅猛發展。參考文獻：1.The Chemistry Behind ADCs.Pharmaceuticals(Basel).2021 May;14(5):44

81、2.36 ADC 的迭代史 前言 抗體偶聯藥物（ADCs）在過去 10 年中取得了長足的進展，ADC 是一種通過一個合理構建的連接子將細胞毒性小分子藥物偶聯到單克隆抗體上的復合物，可以向腫瘤內選擇性地輸送有效的細胞毒性藥物。2009 年，卡利霉素、金盞花素和美登素類藥物是用于 ADC 開發的主要細胞毒素。十年來，這些分子仍然被用作有效載荷進行優化，以獲得更好的穩定性和親水性。新的細胞毒性物質也被開發出來，如 PBDs、杜卡霉素和喜樹堿衍生物等?？贵w工程在 10 年間也已經取得了相當大的進展，允許更多的位點特異性偶聯，提高了ADC 的均一性和穩定性。新的第二代和第三代 ADC 已經進入臨床，以期

82、獲得更好的治療效果和安全性。幾十種基于半胱氨酸殘基、非天然氨基酸或分子工程模式的生物偶聯技術也已經在臨床前研究獲得了驗證。此外，更多的腫瘤特異性抗原靶點和腫瘤內細胞毒性藥物的釋放機制使 ADC 獲得了爆炸式的發展，ADC 藥物進入了黃金時代。第一代和第二代 ADC 一個成功的 ADC 藥物取決于兩個關鍵因素。第一需要一個穩定可靠的連接子連接抗體和有效載荷，這個連接子在血漿循環中保持穩定，并且在腫瘤細胞內吞后迅速切割，以便有選擇地將有效載荷傳遞到腫瘤中，并限制由于非靶向毒性引起的不良反應。連接子需要對溶酶體條件（蛋白酶、酸性和還原介質）敏感。第二個成功的關鍵因素是必須將一種強大的細胞毒性劑偶聯到

83、抗體上。事實上，由于有效載荷（例如蒽環類藥物）的效力較低，第一批 ADC 的特點是治療指數較低，導致到達最大耐受劑量（MTD）時治療效果依然非常有限。Mylotarg、Besponsa 和第一代可切割連接子 Mylotarg 于 2000 年被 FDA 批準用于治療急性髓細胞白血?。ˋML）。它是由卡奇霉素通過一個包含腙鍵的可切割連接子與 gemtuzumab（一種突變的抗 CD33 IgG4 亞型單抗）偶聯而成。這種 ADC 的平均藥物抗體比(DAR)只有 1.5，含有約 50%的未偶聯單克隆抗體。ADC 內化后，腙鍵可在內體酸性環境中水解，釋放出卡奇霉素的前體，然后由谷胱甘肽還原為自由活性

84、的卡奇霉素。后者與DNA 小凹槽結合并經歷 Bergman環化，從而產生高度反應性的雙自由基，引起序列選擇性 DNA 雙鏈切割。從理論上講，腙在生理 pH 值下應在血液循環中保持穩定，并在酸性條件下內化后進行選擇性水解。然而，Mylotarg 的連接子表現出一定的不穩定性，導致卡奇霉素在血37 漿循環中過早釋放，嚴重的毒性導致隨后輝瑞公司在 2010 年將 Mylotarg 退市。得益于近年來在臨床上積累的經驗以及技術的進步，Mylotarg 于 2017 年重新獲批，優化后提高了連接子的穩定性，以較低劑量使用，并修改給藥計劃，適用于不同的患者群體。一個類似的連接子被開發出來并用于將卡奇霉素偶

85、聯到 inotuzumab，一種突變的 CD22靶向抗體上，inotuzumab-ozogamicin(Besponsa）于 2017 年被 FDA 批準用于治療急性淋巴細胞白血?。ˋLL）。Kadcyla 和第二代不可切割連接子 鑒于這些發現，人們繼續開發連接子設計的替代策略。然而，一個偶然的發現使Immunogen 得以識別出一種出人意料的有效 ADC。DM1 通過含有 N-琥珀酰亞胺基-4-（N-馬來酰亞胺甲基）環己烷-1-羧酸鹽（SMCC）的不可切割的連接子與曲妥珠單抗的賴氨酸殘基偶聯，這種 ADC（T-DM1，Kadcyla）于 2013 年經 FDA 批準用于 HER2 陽性乳腺癌

86、患者。這種新型的ADC在HER2陽性乳腺癌模型中非常有效，只有ADC 在內化后在溶酶體中經酶完全消化后，原始結構才具有活性，以獲得活性代謝物 Lys-MCC-DM1。Adcetris,Polivy 和第二代可切割連接子 與此同時，西雅圖遺傳學設計了自己的偶聯技術，通過可切割連接子 mc-VC-PABC，其中包含馬來酰亞胺基間隔子、作為組織蛋白酶底物的標準 Val Cit 二肽序列和 PABC 自降解間隔子，將金盞花素（MMAE）生物偶聯到抗 CD30 抗體的半胱氨酸殘基上，這種 ADC（Adcetris）于 2011 年被 FDA 批準用于間變性大細胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤的治療。Adcetri

87、s 在腫瘤細胞內化后，可切割連接子降解，釋放出的MMAE 能破壞靶細胞并擴散到細胞膜上，到達并殺死鄰近的癌細胞。這種現象被稱為旁觀者效應，允許釋放的 MMAE 殺死 CD30 陽性和 CD30 陰性的腫瘤細胞。類似地，這種第二代連接子（mc-VC-PABC）被用于 Polivy，一種將 MMAE 與 polatuzumab（抗 CD79b 單抗）偶聯的ADC，于 2019 年 6 月被 FDA 批準用于治療成人彌漫性大 B 細胞淋巴瘤（DLBCL）。第三代 ADC 38 由于前兩代 ADC 包括單抗的內化、轉運或再循環有關的干擾、抗原的脫落以及 ADC 的溶酶體降解缺陷都會導致藥物釋放的減少，

88、從而影響 ADCs 的療效。因此，亟需開發與生物偶聯、載體形式、連接子或毒性藥物相關的新技術，以拓寬 ADC 的應用領域，第三代 ADC應運而生。在許多開發 ADC 的公司中，Immunomedics 設計了一個令人驚訝的 ADC。Sacituzumab-govitecan（IMMU-132）是一種抗 TROP-2 單抗，通過具有短聚乙二醇化單元的可裂解馬來酰亞胺連接子與 SN-38（伊立替康的活性代謝物）偶聯。FDA 于 2020 年 4 月批準，這一成就令人印象深刻，因為這種 ADC 用于難治或耐藥的三陰性乳腺癌（TNBC），之前沒有有效的治療藥物。這種 ADC 的另一個有趣的特點是：包括

89、聚乙二醇化單元的連接結構的優化使得該 ADC 的 DAR 高達 7.6，而不會影響其耐受性或效率。DAR=4 長期以來被認為是最佳的，但這一說法現在只適用于已知認可的 ADC，其有效載荷為 DM1 或 MMAE 的第二代接頭。同樣，為了使伊立替康衍生物與精心設計的連接子偶聯，日本第一三共公司開發了 DXd（exatecan 或 DX-8951）。DXd 是一種比 SN-38 體外對癌細胞活性高 10 倍的細胞毒性劑。DXd 具有更好的安全性和最佳的溶解度，能夠引起旁觀者效應殺死鄰近的癌細胞，這在異質性腫瘤中是一個優勢，而且半衰期短，可避免靶外毒性。通過對蛋白水解敏感的馬來酰亞胺連接子將 DXd

90、 生物偶聯到抗 HER2 曲妥珠單抗半胱氨酸殘基上，使得獲得均勻的 DAR 為 7.7 的 ADC（DS-8201a）。盡管 DAR 很高，但第一三共的 DS-8201a 在大鼠和猴子中的耐受性非常好，并且在血漿中非常穩定，顯示出很好的治療效果。Enhertu 于 2019 年 12 月底獲得 FDA 批準。39 ADC 的毒性 Gemtuzumab-Ozogamicin Gemtuzumab ozogamicin（Mylotarg）于 2000 年被 FDA 批準用于治療某些急性髓細胞白血?。ˋML）患者。2001 年，由于觀察到靜脈阻塞性疾病的病例，FDA 發出了警告。2004年，一項隨機

91、研究比較了傳統療法以及與 Mylotarg 聯合的效果，結果由于后者死亡率的增加而提前停止試驗。2010 年 Mylotarg 從除日本外的大多數市場撤出。由于第一次臨床研究中可用的分析方法有限，Mylotarg 后來才被確定為 DAR 方面的異質產品。雖然理論 DAR 值在 2.5 左右，但藥物中 50%以上的抗體沒有被偶聯，其他抗體的DAR 值為 4 或 5。同時，Mylotarg 僅確定一個劑量的方案難以獲得滿意的治療指數，不得不放棄開發。然而，后續法國急性白血病協會（ALFA）的研究表明，將給藥分為三個劑量，既提高了存活率，又沒有發生嚴重不良事件。于是，Mylotarg 于 2017

92、又重新獲批上市。Brentuximab Vedotin Brentuximab vedotin（Adcetris)于 2011 年被批準用于治療某些表達 CD30 的淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和間變性大細胞淋巴瘤。然而，Adcetris 作為單藥治療，臨床上表現出潛在的嚴重周圍神經病變、中性粒細胞減少癥和血小板減少癥，這是抗血小板藥物的典型副作用。另一方面，觀察到進行性多灶性白質腦病的罕見而嚴重的病例。另外，Adcetris 與博萊霉素（一種治療霍奇金病的常用藥物）聯用，發現會導致不可接受的肺毒性，這種組合因此被排除。ADC 的典型或非預期毒性 根據 ADC 的有效載荷藥物分類，如微管破壞劑（a

93、uristatins 和 maytansinoids）、抗有絲分裂抑制劑（KSPis）或 DNA 損傷藥物（calichaemycin 和 PBD），某些毒性是可以預期觀察到的。這些包括可達 4 級的骨髓毒性，敏感的神經和生長毒性。另一方面，也報告一些在標準細胞毒性藥物上沒有觀察到的的副作用。這些包括眼部毒性，如角膜炎或含有 MMAF 或 DM4 的 ADC 引起的角膜沉積物，這可能構成這些 ADC 藥物的限制性毒性。Kadcyla 已經證明會增加放射性壞死的風險。對這些非預期毒性的理解和管理對優化使用這些藥物是至關重要的。ADC 耐藥的機制 ADCs 在腫瘤靶細胞水平上的作用機制包括幾個階段

94、：與抗原結合，內化，藥物釋放（主要在溶酶體中），藥物釋放到細胞質中，藥物作用于靶標誘導細胞凋亡。這些步驟中的每一步都可能與體外或體內的臨床前研究所提示的抗藥性有關：（i）靶抗原的下調和/或抗體的結合、內化、運輸或再循環缺陷；（ii）ADC 的溶酶體降解缺陷或溶酶體轉運體如 SLC46A3 的表達減少，導致胞漿中有效載荷的釋放降低；（iii）微管蛋白或微管動力學調節劑的改變；（iv）通過上調耐藥轉運體如 MDR1 減少藥物在細胞內的滯留。這些潛在耐藥機制的臨床相關性仍有待證實。事實上，在 ADC 治療開始前和治療后復40 發期間獲取腫瘤樣本是很復雜的。另外，在聯合治療的背景下，從其他藥物中辨別抗

95、 ADC的耐藥機制也同樣復雜。小結 在過去的十年中，ADCs 已經通過選擇更好的細胞毒性藥物、生物偶聯方法、更好的靶向抗原和優化的抗體工程得到了改進。然而，它仍存在一些局限性（如有限的實體瘤滲透性和毒性）以及耐藥機制的出現。為了克服這些局限性，人們研究了新的抗體形式、新的傳遞系統、非內化抗原靶點、新的細胞毒性藥物和位點特異性生物偶聯方法來促進 ADC 的發展。雖然許多創新尚未在臨床方案中得到驗證，但這一領域的研究為我們提供了許多令人鼓舞的結果。相信 ADC 未來的十年將會迎來更加輝煌的前景。參考文獻：1.AntibodyDrug Conjugates:The Last Decade.Pharm

96、aceuticals 2020,13,245 41 第三代 ADC 前言 目前在臨床開發或臨床應用中的許多 ADC，都是基于一種完全內化的 IgG 形式，以極高過表達的抗原為靶點，并使用隨機生物結合技術與微管蛋白聚合抑制劑偶聯。已知可裂解連接體在胞漿循環過程中不穩定，而這種疏水性連接體具有較高的聚集傾向。然而，基于完整 IgG 的 ADC 在富含基質的腫瘤中可能會有腫瘤滲透的問題，并且被新生 Fc 受體（FcRn）回收，可能導致內皮和肝臟中的不利分布，從而導致不良反應。此外，在內化后，ADCs 的有效性是基于細胞內轉運到達溶酶體，在那里連接體被降解使藥物受控釋放。然而，這種策略有幾個限制因素：

97、首先，ADCs 的內化能力與表面 Ag 的高表達密切相關（例如，CD30 和 HER2），這解釋了為什么這些使用傳統微管蛋白聚合抑制劑（auristatins 和 maytansinoids）的 ADC 在抗原表達低的細胞上沒有表現出細胞毒性活性。已經有更強大的藥物，例如，吡咯苯并二氮卓（PBD）二聚體開發出來以克服這些局限性，但是相應的 ADC 的治療指數有限，尤其是在實體瘤中。其次，包括 Kadcyla在內的 ADC 通過多種機制誘導腫瘤耐藥。事實上，包括單抗的內化、轉運或再循環有關的干擾、抗原的脫落以及 ADC 的溶酶體降解缺陷都會導致藥物釋放的減少，從而影響 ADCs 的療效。因此，需

98、要開發與生物結合、載體形式、連接體或毒性藥物相關的新技術，以拓寬 ADC 的應用領域。位點特異性的 ADC 盡管 ADC 取得了越來越大的成功，但直到 2019 年，市場上每一個批準的 ADC 都是以異質混合物的形式存在的，單抗上的細胞毒性藥物數量不同且分布在不同的地方，導致了生產過程中的分析問題。事實上，DAR 是不受控制的，這種復雜的混合物會顯著影響 ADC 的藥代動力學和藥效。裸抗體可能是一種競爭性抑制劑，弱 DAR 偶聯物的療效較差，而具有高 DAR 的抗體在血漿中會被迅速消除，從而損害了 ADC 的治療窗口。為了拓寬 ADCs 的治療指數，自 2008年以來，區域特異性生物結合方法得

99、到廣泛發展。這些位點特異性方法可分為三類：（i）天然或非天然氨基酸的生物偶聯，（ii）使用酶的生物偶聯或（iii）基于連接物的生物偶聯。第一種方法是通過抗體工程引入特定的氨基酸。Junutula 和他在 Genentech 的同事是先驅者，他們通過在靶向卵巢癌抗原 MUC16 的單克隆抗體的 265 位氨基酸與 Adcetris連接子進行定點生物偶聯，開發出一種 ADC。為此，他們在單克隆抗體的氨基酸序列中引入了兩種半胱氨酸，選擇了這兩種半胱氨酸來保持 IgG 折疊和與抗原結合。42 將得到的 TDC（ADC-硫單抗）與使用傳統隨機生物結合方法生成的 ADC 進行比較。兩種 ADC 在小鼠異種

100、移植模型中均有效，但 TDC 在大鼠和食蟹猴體內的耐受性高于ADC，并且在體內表現出較低的全身毒性。受此策略的啟發，Seattle Genetics 和 Spirogen開發了一種類似的技術，稱為 MAIA，通過在 mAb 關鍵區域的 239 位引入絲氨酸半胱氨酸突變，實現 PBD 二聚體的生物偶聯。第二種可能性是使用酶介導的區域特異性生物結合技術。谷氨酰胺轉胺酶催化天然單抗的谷氨酰胺側鏈與含有伯胺的分子之間形成酰胺鍵?；诖?，Innate Pharma 已經開發了一種使用谷氨酰胺轉胺酶構建 ADC 的三步方法，如下圖所示。最后，區域特異性 ADC 也可以從天然單抗中產生。在這一策略中，由創新

101、的二溴甲基酰胺（DBM）或二噻吩基馬來酰亞胺（DSPh）組成的異質雙功能連接體可以通過區域特異性生物偶聯產生更均勻和更穩定的 ADC，DAR 為 4。其它 ADC 形式 盡管其療效顯著，但大多數針對實體腫瘤的 ADC 并沒有超過 2 期臨床試驗的進展，這表明，為了進入市場，還需要優化其他參數。ADC 的有效性受到其大?。?50 kDa）的限制，與腫瘤的穿透和吸收不良有關。除了 IgG 的大小，現在人們認為 IgG 的 Fc 部分對于 ADC 的療效來說是不必要的，甚至是不需要的，事實上，由 FcRn 誘導的 ADC 半衰期較長增加了對健康組織的暴露，而 FcR 與內皮細胞和免疫系統發生交叉反應

102、，這兩種現象與靶外毒性有關。較小的結合形式已被探索以彌補這些缺點，特別是肽、單域抗體片段（sdAb 或VHH）、單鏈抗體（scFv）、抗原結合片段（Fab）或使用 CH4 結構域二聚化的小免疫蛋白（SIP）。作為該策略的一部分，最近，auristatin 衍生物與抗 HER2 單鏈抗體（源自曲妥珠單抗）的位點特異性偶聯產生了兩種新的單鏈抗體藥物偶聯物（SDCs）。43 與天然單鏈抗體相比，這兩種 SDC 保持了對 HER2 的親和力，并且能夠在體外有效地殺死 SK-BR-3her2 陽性細胞（EC50 分別為 0.68nm 和 0.32nm），對 HER2 陰性 MCF-7 細胞無影響。盡管

103、DAR 為 1 的 SDC 不如相應的 DAR 為 4 的 ADC 強大，但這項工作代表了設計具有更高 DAR 的更有效的小型結合物的第一步，為進一步的體內或甚至臨床研究開辟了道路，以評估其對實體瘤的潛力。目前以 HER2 為靶點的 ADC 在清除表達相對較低 HER2+癌細胞方面是無效的。因此，只有大約 20%的乳腺癌患者有資格接受 HER2 靶向治療。此外，HER2 表達的腫瘤內異質性最終導致最初對治療有反應的患者復發。為了在具有更廣泛 HER2 表達范圍的癌細胞中獲得有效的抗腫瘤活性，MedImmune 開發了針對 HER2 的雙翼 ADC IMMU4276。與 Kadcyla相比，在代

104、表不同亞群患者的各種腫瘤模型中，這種雙翼 ADC 顯示出優越的抗腫瘤活性。此外，兩個組合突變（L234F 和 S239C）減少了與 FcR 的結合，以減少 FcR介導的正常組織中ADC特異性內化，從而減少了血小板減少等副作用的發生。不幸的是，由于高肝毒性，2018 年該 ADC 也在臨床停止。新靶標和相關釋放系統 在富含細胞間質的實體瘤中，在癌細胞表面靶向內化抗原是非常困難的。因此，一種新的方法被開發出來，由腫瘤微環境（基質或血管系統）代替癌細胞。在這種策略中，細胞外蛋白酶和細胞外基質的其他成分（如酸性介質或還原性谷胱甘肽）可用于有效的細胞外釋放用于非內化 ADC 的細胞毒性。纖維連接蛋白是腫

105、瘤內皮下細胞外基質的一種成分，與癌細胞表面相比，更容易獲得免疫結合。SIP 形式是單鏈抗體片段與人 IgECH4 結構域融合的結果。SIP（F8）在 C-末端位置用兩個未成對的半胱氨酸殘基生成，允許兩個 DM1 分子進行區域特異性生物偶聯，以產生 SIP（F8）-SS-DM1 的 DAR=2 的偶聯物。44 在治療實驗中，SIP（F8）-SS-DM1 比 IgG（F8）-SS-DM1 的類似物效果更好。在 F9 畸胎瘤小鼠模型中，以 5mg/kg 5 次注射給藥，以相等（等摩爾）劑量在體內比較兩種偶聯物。SIP 偶聯物使五分之四的小鼠腫瘤完全緩解，而 IgG 結合物僅觀察到有限的腫瘤緩解。這兩

106、種結合物也被證明在細胞毒性DM1釋放動力學方面存在顯著差異。非內化ADC的優點是避開了免疫結合物內化的某些抵抗機制，而區域特異性生物結合方法控制 DAR，避免了 DAR 為 0 的成分出現。新型細胞毒性藥物 新的細胞毒藥物已經被開發出來，以靶向低抗原表達或對 auristatins 或 maytansinoids耐藥的癌細胞。為此，人們開發了 PBD 二聚體，這些二聚體的分子結構包含兩個烷基化亞胺官能團，能夠與 DNA 形成共價鍵。PBD 二聚體比傳統細胞毒性藥物（MMAE 或 DM1）的效力高約 50-100 倍。Spirogen 和 Seattle Genetics 將 PBD 二聚體作為

107、 ADC 細胞毒性物質引入，并開發了 SGN-CD33A（vadastuximab-Talinine）和 SGN-CD70A，然而很不幸，這兩種基于 PBD 的 ADC 最近在 III 期臨床試驗中被迫停止。SGN-CD33A 與致命感染和可能的肝毒性導致的較高的患者死亡率相關，而SGN-CD70A 與血小板減少有關。雖然在臨床試驗期間停止了使用talirine 的 ADC，但兩個使用相應的tesirine 的 ADC 處于臨床研究的高級階段。Rovalpituzumab tesirine（Rova-T或SC16LD6.5）是 由abbvie（Stemcentrx）開發的抗 DLL3 ADC，

108、在小細胞肺癌的III期臨床試驗中進行了測試。ADC Therapeutics 開發了 loncastuximab-tesirine（ADCT-402）和 camidanlumab-tesirine（ADCT-301），這兩種藥物都在關鍵的 II 期臨床階段分別針對 B 細胞急性淋巴細胞白血病和霍奇金淋巴瘤進行了測試。45 Genentech 最近開發了一種新的抗 CD22-NMS249 ADC，新的蒽環類化合物命名為 PNU-159682。蒽環類藥物是目前應用最廣泛的化療藥物之一，在治療侵襲性非霍奇金淋巴瘤（NHL）方面非常有效。該 ADC 使用 MC-VC-PAB-DEA 接頭，帶有一個加長

109、的自鎖間隔區，除了傳統的 PAB 外，還包括 N，N-二甲基乙二胺（DEA）。在體內，這種抗 CD22-NMS249 ADC 在異種移植瘤模型中與抗 CD22-VC-MMAE ADC 一樣有效，而在基于抗 CD22-VC-MMAE ADC 的細胞系的模型中仍然有效。證明了蒽環類 ADC 在治療 MMAE耐藥癌癥中的有效性。作為先前所述 ADC 的替代品，海德堡制藥公司開發了一種稱為 ATAC（針對抗體靶向鵝膏蛋白結合物）的專利技術，該技術基于強 RNA 聚合酶 II 抑制劑。-和-鵝膏堿是兩種著名的鵝膏毒素，在四十多年前的蘑菇中鑒定出來。HDP-101 是由 HDP30.2115（-鵝膏蛋白的

110、穩定類似物）通過組織蛋白酶 B 敏感連接物與靶向 B 細胞成熟抗原（BCMA，CD269）的硫單抗（由 Genentech 設計）定點偶聯，產生 DAR 為 2 的 ATAC。BCMA 已經成為治療多發性骨髓瘤的一個非常有選擇性的靶點。在體內，在多發性骨髓瘤的各種異種移植模型中，HDP-101 導致小鼠腫瘤完全緩解，安全性研究在小鼠和猴子身上確定了一個非常有利的治療窗口。ATACs 是一類非常有前途的化合物，但目前仍處于臨床前階段。第三代的成功典范：Enhertu 和 Trodelvy 在許多開發 ADC 的公司中，Immunomedics 設計了一個令人驚訝的 ADC，通過三重賭注：構建一個

111、針對稍微過表達靶點的 ADC，使用了一個混合了細胞內和細胞外釋放的系統，以及比常規使用的有效載荷更弱的毒性藥物。Sacituzumab-govitecan（IMMU-132）是一種抗 TROP-2 單抗，通過具有短聚乙二醇化單元的可裂解馬來酰亞胺連接體與 SN-38（伊立替康的活性代謝物）偶聯。FDA 于 2020 年 4 月批準，這一成就令人印象深刻，因為這種 ADC 用于難治或耐藥的三陰性乳腺癌（TNBC），之前沒有有效的治療藥物。這種 ADC 的另一個有趣的特點是：包括聚乙二醇化單元的連接結構的優化使得該 ADC 的 DAR 高達 7.6，而不會影響其耐受性或效率。DAR=4 長期以來被

112、認為是最佳的，但這一說法現在只適用于已知認可的 ADC，其有46 效載荷為 DM1 或 MMAE 的第二代接頭。同樣，為了使伊立替康衍生物與精心設計的連接體結合，日本第一三共公司開發了 DXd（exatecan 或 DX-8951）。DXd 是一種比 SN-38 體外對癌細胞活性高 10 倍的細胞毒性劑。DXd 具有更好的安全性和最佳的溶解度，能夠引起旁觀者殺傷效應殺死鄰近的癌細胞，這在異質性腫瘤中是一個優勢，但半衰期短，可避免靶外毒性。通過對蛋白水解敏感的馬來酰亞胺連接體將 DXd 生物結合到抗 HER2 曲妥珠單抗半胱氨酸殘基上，使得獲得均勻DAR為7.7的共軛fam-trastuzuma

113、b-deruxtecan nxki（DS-8201a）。盡管 DAR 很高，但第一三共的 DS-8201a 在大鼠和猴子中的耐受性非常好，并且在血漿中非常穩定。DS-8201a 能夠在體內有效地將 DXd 輸送到異質性腫瘤中，并顯示出很高的治療效果。去年，在轉移性 HER2 陽性乳腺癌的 III 期臨床研究中，DS-8201a 成功地與 T-DM1 進行了比較，并最終于 2019 年 12 月底獲得 FDA 批準。參考文獻：1.AntibodyDrug Conjugates:The Last Decade.Pharmaceuticals 2020,13,245 47 ADC 的耐藥機制 前言

114、抗體偶聯藥物（ADC）是一種利用單克隆抗體選擇性靶向表達特定抗原的細胞，并遞送細胞毒性有效載荷的新型藥物，旨在最大限度地減少化療藥物的脫靶毒性。近年來，ADC 在乳腺癌和其他惡性腫瘤中的成功試驗表明，ADC 可以有效地殺傷腫瘤細胞并限制毒性，在某些情況下可以取代傳統的化療。雖然這些藥物取得了顯著的成功，特別是在轉移性環境中，但幾乎所有接受 ADC 治療的晚期患者都會產生耐藥性。潛在的耐藥性機制可以根據抗體偶聯藥物的復雜結構進行分類。分為抗原表達的變化、ADC的處理以及有效載荷變化的臨床前和臨床耐藥性機制。用這種方法對耐藥性機制進行分類為未來的研究提供了方向，以進一步了解這些機制和藥物開發的新靶

115、點，從而擴大 ADC 的療效?？乖磉_的變化 在 T-DM1 的早期試驗中，觀察到 HER2 表達更高、更均勻的腫瘤更有可能對治療產生反應。鑒于 HER2 可能具有相當異質性的表達，需要一致更高 HER2 表達的藥物在 HER2 水平發生任何變化時都會遇到耐藥性。這一假設的進一步證據包括觀察到 HER2+腫瘤在治療后表現出較低的 HER2 表達，并且更多的異質性表達與更高的復發率和更低的生存率相關。一項針對接受新輔助 T-DM1 和帕妥珠單抗治療的早期 HER2+乳腺癌患者的研究發現，治療前存在的 HER-2 異質性與治療反應呈負相關。在那些具有異質性預處理活檢的患者中，沒有患者獲得病理學完全

116、緩解（pCR），而 55%的非異質性患者在 T-DM1 和帕妥珠單抗的聯合作用下獲得 pCR。除了異常的抗原表達水平外，抗原與另一個細胞表面受體的二聚化可能能夠介導對48 ADC 的耐藥性。NRG-1，一種已知可引發 HER2/HER3 異二聚化的配體，在 HER2 擴增的乳腺癌細胞系亞群中抑制了 TDM-1 的細胞毒性活性。這種耐藥性可以通過添加帕妥珠單抗來克服，帕妥珠單抗是一種阻斷HER2/HER3二聚化和下游信號傳導的單克隆HER2抗體。TDM-1 和 Pertuzumab 的組合在體外和體內腫瘤異種移植物研究中均顯示出協同作用?？紤]到抗原異質性在介導 ADC 耐藥性中的影響，未來解決這

117、種耐藥性的策略可能包括具有雙重抗體的藥物（雙特異性 ADC），以及增加抗原表達的聯合療法。ADC 的攝取和加工 另一種 ADC 耐藥性的假說涉及細胞內攝取和加工的改變。ADC 的復雜性，特別是與小分子相比，為出現耐藥性提供了許多可能的機會。一種提出的機制是由于一些屏障導致對細胞的滲透減少，如細胞基底膜的增加。另一個提出的機制來自最近的臨床前研究，ADC 確保特異性的一種機制是通過網格蛋白介導的在表達靶抗原的細胞中進行內吞攝取。在對 T-DM1 產生耐藥性的 N89-TM 細胞系中，發現了另一種攝取機制，其中細胞使用小窩蛋白-1（CAV1）包被的囊泡，這可能導致效率降低。最近一項研究發現，腫瘤

118、CAV1 水平與 T-DM1 腫瘤攝取之間呈負相關。CAV1 的遺傳或藥理學抑制增加了 T-DM1 的攝取，并在多種異種移植物模型中顯示出與 T-DM1 的協同作用。此外，還發現對 T-DM1 具有耐藥的 JIMT1-TM 細胞系還顯示包括 Rab5B、ATG9a 和 HTT在內的蛋白質的增加，這些蛋白質介導溶酶體加工和囊泡的運輸。在 JIMT1-TM 細胞系中，可裂解和不可裂解連接子的 ADC 在溶酶體中的共定位時間都比在親本細胞中長。與親本細胞相比，耐藥性細胞系的連接子-有效載荷代謝產物都減少了。有效載荷 一些觀察到的耐藥機制涉及有效載荷本身，并且可以通過使用具有替代有效載荷的ADC 來克

119、服。例如，對含有拓撲異構酶抑制劑有效載荷的 ADC 的耐藥性可能是由拓撲異酶表達的變化或下游信號機制的變化驅動的。在非霍奇金淋巴瘤的腫瘤模型中觀察到了這一點，其中將含有 auristatin 有效載荷的ADC 改變為含有蒽環類有效載荷的 ADCs 導致對治療的響應增加。類似地，在對 T-DM1 具有抗性的癌細胞中，這些細胞仍然對 DS-8201a（T-DXd）敏感。49 由 ATP 結合盒轉運蛋白介導的 ADC 有效載荷的流出增加是另一種提出的耐藥機制。與親本細胞相比，轉運蛋白在對 T-DM1 具有抗性的細胞中的表達增加，高達 20-50 倍。這是gemtuzumab ozogamicin（G

120、O）耐藥性的一種機制，編碼 ATP 結合盒的 ABCB1 基因水平較低的患者對 GO 的反應有所改善。小結 雖然 ADC 的廣泛應用為患者提供了新的治療選擇，但大多數腫瘤最終會對這些藥物產生耐藥性。鑒于 ADC 的復雜性，針對 ADC 的不同組件都可能涉及不同的耐藥機制?？乖磉_減少、ADC 運輸和加工減少、對細胞毒性有效載荷的耐藥性以及藥物流出細胞的增加等機制都是潛在的靶向過程，可用于未來的藥物開發。優化 ADC 的順序治療和聯合治療的研究有望為克服耐藥提供更多的線索，并促進新的治療選擇，擴大這些療法的臨床療效。參考文獻：1.Mechanisms of Resistance to Antib

121、ody-Drug Conjugates.Cancers(Basel).2023 Feb 17;15(4):1278 50 ADC 藥物的內吞機制 前言 ADC 對于藥物靶點的選擇，除了首先要在腫瘤過度表達外，這些抗原的另一個重要因素是內吞的效率，這是藥物釋放活性所必需的。事實上，ADC 的療效取決于靶向介導的內化在腫瘤細胞內傳遞有效載荷的效率。ADC 內化的途徑和效率，也與 ADC 藥物的療效和設計息息相關。因為它是連接子選擇可切割、不可切割或 pH/還原敏感型的重要因素，以及有效載荷（或其活性代謝物）是否能夠在細胞膜上擴散以提供“旁觀者效應”，還有是否提高了腫瘤殺傷率或有助于劑量限制毒性。因

122、此有必要深入了解 ADC 的內吞作用和機制，因為它是 ADC 在體內發揮藥效中極其重要的第一步。ADC 的相關內吞途徑 一般來說，正常的內吞作用可分為三個階段：（1）芽的形成，（2）膜的彎曲和囊泡的成熟，（3）膜的斷裂并釋放到細胞質中。多種內吞途徑有重疊的方面，因此內吞的一般過程是高度靈活和復雜的。網格蛋白介導的內吞作用 網格蛋白介導的內吞作用（CME）在概念上是一個簡單的過程，包括幾個連續和部分重疊的步驟。CME 可由質膜上的某些受體結構性啟動，或者需要配體和/或抗體結合后啟動。當細胞質中的內吞衣殼蛋白開始聚集在質膜的內小葉上時，CME 就開始了。衣殼蛋白通過從細胞質中招募并與額外的蛋白質適

123、配器相互作用而繼續組裝和生長。關鍵的銜接蛋白使膜彎曲，從而將內化受體/配體集中到一個“網格蛋白包被坑”（CCP）中。由于 CCP 內陷增大，CCP 頸縮窄時，通過一個斷裂過程與質膜分離。肌動蛋白聚合有助于將 CCP 向內拉入細胞質，直到斷裂完成，CCP 釋放并成為一個網格蛋白包被的囊泡（CCV）。最后，CCV 外殼被分解，CCV與內涵體融合以運輸到特定的亞細胞位置，或者可以被回收回細胞表面。網格蛋白是 CME 的關鍵成分，由重鏈和輕鏈組成。三個網格蛋白重鏈和輕鏈形成一個三聚體，它與其他三聚體相互作用，并在新興的 CCP周圍形成一個多邊形晶格。銜接蛋白 2（AP-2）是一種異源四聚體復合物，它介

124、導 CCP 頸部的收縮。Dynamin 是一種 GTP酶，在成熟囊泡的頸部形成螺旋狀聚合物。GTP 水解后，dynamin 誘導囊泡從質膜分裂。51 小窩介導的內吞作用 不依賴于網格蛋白的內吞作用包括小窩介導的內吞作用、小窩蛋白非依賴性載體蛋白/GPI-富集的早期內區室（CLIC/GEEC）和巨胞飲作用。小窩是質膜的小瓶狀內陷，其特征是高水平的膽固醇和鞘糖脂，通過不依賴于網格蛋白的途徑介導內吞作用，并且存在于大多數細胞類型中。小窩的主要支架蛋白是小窩蛋白，它是形成寡聚體的 2024 kDa 完整膜蛋白。小窩蛋白共享共同的支架結構域，這些支架結構域介導與自身和其他包含小窩蛋白結合結構域蛋白質的相

125、互作用。雖然小窩具有類似 CCPs 的內陷形態，但它們是不同的。簡單地說，CCP 的密度是恒定的，而小窩的密度會因細胞類型的不同而變化很大。CCPs 隨著萌發的內體成熟而增大，相比之下，小窩囊泡保持不變的大小。一旦進入細胞內，小窩就形成了高階結構，而不是由 CCPs 形成的簡單的球形內體。小窩蛋白介導的內吞作用的另一個獨特方面是，只有約 1%的小窩是從質膜上萌發的。在一小部分內化的小窩中，它似乎遵循一條與 Rab5（早期內胚體的標志物）共定位的循環途徑。這可能對以利用小窩蛋白介導內吞作用的受體為靶點的 ADC 帶來挑戰。CLIC/GEEC 內吞作用 CLIC/GEEC 是一種內吞室，主要發生在

126、配體激活的細胞中，這可能由生長因子、抗體的受體交聯或細菌毒素和病毒引起。此外，細胞膜必須處于高流動性狀態，因為 CLIC/GEEC 在低于生理溫度或膜處于更高張力的情況下不起作用。CLIC 在 遷 移 細 胞 的 前 緣 增 加。識 別CLIC/GEEC 途徑的其他相關參數包括動力非依賴性質膜斷裂、對膽固醇消耗的敏感性、Rab5/與早期內體融合的獲得、胎盤堿性磷酸酶（PLAP）和與 FAK 相關的 GTPase 調節因子（GRAF1）。巨胞飲作用 巨胞飲作用是一種更大規模的內吞作用形式，通常涉及質膜高度皺折的區域/突起，這些區域/突起隨后相互融合或與質膜融合。膜皺褶是巨胞飲作用的形態學特征。巨

127、胞飲作用依賴于肌動蛋白聚合、Rac1 蛋白和 p21 活化激酶 1（PAK1）。PAK1 是一個關鍵的調節因子，因為它與 Rac1 相互作用，Rac1 激活磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、Ras、Src 和 Hsp90，以促進巨胞飲作用。巨胞飲作用也是膽固醇依賴性的，這是招募 Rac1 所必需的。這些成分最終導致比 CME 和小窩蛋白更大吸收面積的內吞作用。52 ADC 靶向抗原的內吞特性 CD33 CD33 是一種 67kda 跨膜糖蛋白受體，通常在正常髓系細胞上表達，由于其在 AML 細胞上優先過表達，是 GO 的靶點。CD33 的胞內免疫受體酪氨酸基抑制基序（ITIM）調節 CD33的

128、內吞作用，可通過 CME 激活內吞作用。關于內吞效率，AML 細胞中 CD33 的表達水平與其內吞率之間沒有相關性。CD33 是一種緩慢內化的抗原，此外，CD33 交聯并不能改善內吞作用。對 GO 無響應的 AML 患者可能與 CD33 受體內吞的功能低下有關。CD30 CD30 是一種 120kda 跨膜糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族。其細胞外部分由六個擴展構象的富含半胱氨酸的結構域（CRD）組成。CD30 在活化的 T 細胞和 B 細胞以及各種淋巴腫瘤（包括霍奇金淋巴瘤和 ALCL）上表達。CD30 不具有內吞作用，相反，它因蛋白水解裂解而脫落，CD30 的脫落由基質金屬蛋

129、白酶（MMPs）介導。脫落是 CD30 生物學的一個特征，高濃度的循環可溶性 CD30 可以作為監測腫瘤進展的血清標志物。對于 ADC 的療效，升高的 CD30 循環水平似乎會隔離注射的 ADC，從而減少能夠定位于 CD30 陽性腫瘤部位的 ADC 的數量。因此，缺乏內吞作用的結果表明 CD30 不是理想的 ADC 靶點。CD22 CD22 是一種 140 kDa 的跨膜糖蛋白，與 CD33 一樣，它也是 Siglec 家族的成員，并與該家族共享多種結構特征。關鍵的區別在于 CD22 比 CD33 大得多，因為它有多個 Ig 結構域和 ITIM/ITIM 樣基序。CD22 的表達僅限于 B 細

130、胞，CD22 在各種 B 細胞惡性腫瘤（包括ALL）的大多數母細胞中表達水平升高。CD22 通過 CME 進行內吞作用。類天然配體通過 CD22 的結構性快速內吞在細胞內積聚。這些配體在溶酶體中被分類降解，而 CD22 則循環回到細胞表面。此外，CD22 配體誘導的內吞激活細胞內池，補充或增加細胞表面 CD22 的表達水平。因此，CD22 對 ADC 具有良好的內吞特性。53 CD79b CD79b 僅在未成熟和成熟的 B 細胞中表達，在惡性腫瘤80%的 B 細胞中過表達。CD79a和 CD79b 是兩種非共價結合的跨膜蛋白，介導信號傳導和內吞作用。對于后者，CD79a-CD79b 異二聚體是

131、控制 BCR 內吞的支架。BCR 內吞作用主要由 CME 完成，并由 AP-2 介導。有趣的是，CD79a 直接與 AP-2 的亞單位相互作用，進而激活 CD79b 并導致整個 BCR 復合物的內吞。此外，對于 ADC 來說，CD79a 可以作為單體內化，但 CD79b 卻不能。如果 CD79b 的近端膜酪氨酸（Y195）發生突變，AP-2 與 CD79a 的結合就會被阻斷，內吞也被阻斷。在 18%的活化 B 細胞樣 DLBCL 標本中，Y195 發生突變?？傊?，有證據表明 CD79b 其內吞活性依賴于整個 BCR 復合體的內化，而不是作為單體的內化。TROP-2 Trop2 是一種 46kD

132、a 的單體糖蛋白，具有選擇性過度表達、結構性內吞作用和導向溶酶體等特性，使其成為 ADC 的一個非常有吸引力的靶點。Trop2 的內化機制與 CME 有關。觀察到的 Trop2 強大的內吞作用，一種潛在的解釋可能是由于顯著的 Trop2 聚集。研究Trop2 的構象動力學，發現 Trop2 通過位于跨膜結構域的氨基酸“VVVVV”組成的相互作用片段形成天然的同型二聚體。Trop2 的二聚作用可以通過其他細胞表面蛋白質進一步將 Trop2單體招募到更接近的位置。因此，Trop2 簇很可能由多個二聚體通過脂筏和其他膜結合蛋白連接而成。Trop2 與多種配體結合，如 claudin-1、claudi

133、n-7、cyclin D1 和 IGF1，然而，這些配體都沒有證明在與 Trop2 結合或相互作用時被內化。因此，與正常細胞相比，Trop2 在腫瘤細胞中發生的內吞作用更為強烈，這些都表明 Trop2 是 ADC 的一個很好的靶點。BCMA BCMA 或 CD269，也稱為 TNFR 超家族成員 17，轉導誘導 B 細胞存活和增殖的信號。BCMA 的分子量僅為 20.2 kDa，其配體結合的胞外區域具有“臂椅”構象，由六個 CRD 組成。除了多發性骨髓瘤外，BCMA 還表達于許多血液系統惡性腫瘤，如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。然而，關于 BCMA 所利用的精確內吞途徑的知之甚少。與內吞作用有

134、關，唾液酸化是一種調節功能，它可能誘導 BCMA 利用 CME 發生內吞作用。HER2 HER2 是一種 185kda 跨膜糖蛋白，屬于 EGFR 家族。HER2/neu 基因的擴增是已知的人類惡性腫瘤和轉移的驅動因素。由于HER2在癌癥中的作用，幾十年來一直被作為治療靶點。HER2 也一直是 ADCs 的靶點，T-DM1 和 T-DXT 都被批準用于 HER2 陽性轉移性乳腺癌患者。HER2 的內吞存在多種機制，首先是 CME，共免疫沉淀清楚的顯示 HER2 直接與 AP-2結合，此外，dynasore 能完全阻斷 SKBR3 細胞的 HER2 內吞作用；其次小窩蛋白結合基序xxxxx（代表

135、芳香族氨基酸 Trp、Phe 或 Tyr）通常存在于小窩蛋白相關蛋白上，有趣的是，序列 WSYGVTIW 已在 HER2 的細胞內激酶結構域中被鑒定出；另外，有研究證明 HER2可以利用 CLIC/GEEC 的內吞途徑。54 這些不同的發現揭示了 HER2 內吞的重要特征。首先，HER2 的內吞作用是混雜的，其次，小窩介導的內吞途徑似乎更常被利用。Nectin-4 Nectin-4 是一種 66 kDa 的 I 型跨膜蛋白，其主要作用是促進細胞間的接觸。Nectin-4作為 ADC 靶點很有吸引力，因為研究表明，它在幾種腫瘤類型中過表達，但在正常成人組織中幾乎不存在。目前，沒有發現天然配體或

136、mAb/ADC 與 nectin-4 的復合物內吞的信息，但是可以借鑒nectin-4 結合病原體內吞的研究。Nectin-4 也是麻疹病毒的受體，研究表明，麻疹病毒通過巨胞飲作用進入 MCF7、HTB-20 乳腺癌和 DLD-1 結直腸癌細胞。病毒進入需要 PAK1，相反，dynamin 抑制劑 Dynasore 對病毒進入沒有影響。此外，表達顯性負性小窩蛋白的細胞并不能消除病毒的內吞作用?；谶@些間接研究，nectin-4 表現出病毒受體所需的強大的內吞活性。小結 藥物劑量-暴露-效應關系的確定是 ADC 成功的關鍵部分，內吞作用是這種關系的關鍵部分，因此，對于優化給藥方案以最大限度地提高

137、治療指數非常重要。然而盡管目前 ADC 領域如火如荼，但是我們對靶受體的內吞作用仍知之甚少。另外，許多內吞作用的核心成分和關鍵的效應器非常重要，然而這些蛋白可能在癌癥中普遍發生突變，這也會影響 ADC 內吞作用和療效。相信隨著該領域的發展，經過無數次積累的經驗，ADC 終會迎來真正的春天。參考文獻：1.Impact of EndocytosisMechanisms for the Receptors Targeted by the Currently Approved Antibody-DrugConjugates(ADCs)A Necessity for Future ADC Researc

138、h and Development.Pharmaceuticals(Basel).2021 Jul;14(7):674.55 ADC 藥物的免疫原性 前言 蛋白藥物具有誘導免疫原性的潛力，其后果可能影響療效甚至危及生命。生物治療的新模式，如抗體偶聯藥物（ADC）、融合蛋白和聚乙二醇化都會攜帶非天然的人類蛋白質序列和/或結構基序，可能增加其免疫原性風險。因此，需要全面的風險評估、策略和分析來監測和表征 ADC 和其他生物治療的免疫原性，以預測和了解潛在的臨床效果。ADC 由單克隆抗體（mAb）通過穩定的連接物共價連接到細胞毒性劑，其結合了單抗對腫瘤細胞表面靶抗原的特異性和細胞毒性藥物的高效性。雖

139、然目前的 ADC 使用人源或人源化的單抗和小分子有效載荷，但與治療性單抗相比，其半抗原樣結構可能會增加其免疫原性潛力?？顾幬锟贵w（ADAs）可以針對 ADC 中的不同結構域，如 mAb 表位、mAb 新表位、接頭和細胞毒性劑。如果大的 ADC-ADA 免疫復合物被非靶向免疫細胞攝取而導致細胞死亡，則抗細胞毒性劑的 ADAs 存在潛在的安全風險。人們普遍認為，評估生物治療藥物免疫原性所遵循的行業慣例和監管指南可適用于ADC。ADC 免疫原性評估的關鍵是風險評估、適當的檢測和 ADA 結構域特異性的附加特征。免疫原性風險評估包括與患者和產品相關的各種已知因素，這些因素可能影響到藥物的免疫原性以及免

140、疫反應的潛在后果。對于 ADC，該風險通常被認為高于治療性單抗?；陲L險評估，這里對在 11 個臨床試驗中對 8 個 ADC 藥物進行了免疫原性數據分析，這些臨床試驗涉及一系列實體腫瘤和血液學腫瘤適應癥。對于每個 ADC，基線時 ADA 的發生率、治療后的發生率和免疫反應的其他特征進行了評估。ADAs 基線發生率 從所有 ADC 研究中獲得的 ADAs 數據的基線發生率來看，ADAs 的基線發生率在 1.4%到 8.1%之間，這處于其他單克隆抗體衍生生物療法報告的范圍內，包括 ADC 藥物 Kadcyla。在這 8 個 ADC 抗體的臨床研究中，這些抗體不太可能與 ADC 的其他成分有關。此外

141、，在所評估的 8 個 ADC 中，未經治療的患者群體樣本中的背景信號與來自健康志愿者的混合56 血清對照信號相似。ADC 治療后 ADAs 的發生率 基線后 ADAs 的發生率在 0 到 35.8%之間，以血液腫瘤為靶點的 ADC 患者比以實體瘤為靶點的 ADA 患者要少，總共 169 例中有 8 例，而實體瘤 459 例中有 83 例，這可以歸因于血液腫瘤患者的免疫殺傷。然而，ADA 的發生率也有一些例外，例如 ADC C 靶向漿細胞的 ADA 發生率為 25.9%，而黑色素瘤的 ADC G 發生率為 0%，但患者接受糖皮質激素作為治療的一部分，具有已知的免疫抑制作用。對 ADC A 和 I

142、 也進行了一些研究，ADC A 只在一項研究中只有一名患者出現了治療誘導的 ADA。而關于 ADC I，研究中 ADA 陽性患者的數量在 5 到 18 之間，相應的 ADA 發生率在 20.8%到 32.0%之間。此外，但值得注意的是，在 I 期研究中，卵巢癌患者 ADA 發生率高于肺癌患者，分別為 31.0%（9/29）和 16.4%（9/55）。在 II 期研究中，卵巢癌患者也觀察到 ADA 發生率相似。ADA 免疫反應的特點 對于在這里評估的八個 ADC，大多數 ADA 是針對 ADC 的 mAb 結構域，范圍在 86%到100%之間。這些結果與 Adcetris（brentuximab

143、-vedotin）的結果相似，Adcetris 與本文介紹的八種 ADC 具有相同的接頭和毒性藥物?？偟膩碚f，這些數據表明，與傳統的治療性單克隆抗體相比，在大多數患者中，這些 ADC的半抗原樣結構似乎不會增加其免疫原性風險。至于 ADA 水平，這些 ADC 的總滴度范圍很廣，從小于 1.30 到 4.92 滴度單位，所有 ADC的平均滴度超過 2.50 滴度單位。對于治療誘導的 ADA 發生時間，顯示 ADAs 的發生在所有 ADC 中是可變的，ADA 發生的時間范圍在 3 到 42 周之間。此外，8 個 ADC 中的 6 個在開始治療后 3 到 6 周內有60%以上的患者出現 ADAs。所有

144、ADC的大多數應答都是持續的，ADC H和I的瞬時應答最高（分別為43.8%和34.1%）。然而，在腫瘤學研究中將 ADA 反應分為持續性或短暫性可能會產生誤導，因為治療時間通常較短。事實上，對 ADA 陽性反應的更詳細的數據評估表明，三個 ADC（ADC F、H 和 I）的 ADA 陽性率較高。652 例患者中有 33 例在基線檢查時已有抗體，其中 3 例 ADA 反應增強。這三名患者的57 ADA 滴度隨時間變化,基線滴度在 1.89 到2.71 之間，而基線后滴度在 2.50 到 4.10 之間。3 名患者中有 2 名在治療后的第一個基線后時間點出現 ADA 峰值，出現增強反應的時間范圍

145、為 3 至 9 周。所有患者最后一個時間點的 ADA 水平均低于峰值水平。ADA 結構域特異性在基線和基線后時間點保持不變。ADA 對其它臨床數據的影響 免疫原性是蛋白藥物臨床特征的重要組成部分，其數據應在其他因素（如療效、PK 和安全性）的背景下進行評估。這里我們集中在產生 ADA 的患者數量較高的三個 ADC，即 ADC F、H 和 I，分別有 19、16 和 43 名基線后 ADA 陽性反應的患者。ADC F 的 ADAs 的發生率為 35.8%（19/53），18 例患者為治療誘導型 ADAs，1 例為治療增強型 ADAs?？偟膩碚f，與沒有產生 ADC F 抗體的患者相比，在 PK、安

146、全性或療效結果方面沒有觀察到差異。此外，ADA 滴度對這些患者的 PK 有影響，但先前在食蟹猴中已有報告。至于 ADC-H，ADAs 的發生率為 25%（16/64），所有 16 例患者都有治療誘導的 ADAs。與 ADCF 相似，一些 ADA 滴度較高的患者的總抗體波谷水平低于 ADA 滴度較低的患者，但總的 ADA 滴度較高的患者與總抗體水平較低的患者并不對應。ADC共有 43 例患者出現 ADAs，41 例患者誘導，2 例患者增強。值得注意的是，7 名患者（包括 2 名 ADAs 增強患者）在一個或多個低谷時間點的總抗體水平低于檢測水平。但仍需要進行全面的分析才能得出結論：ADA 滴度對

147、這些患者的 PK 有影響。然而，值得注意的是，高 ADA 滴度值（4.00）對食蟹猴 trastuzumab ADC 的 PK 曲線有顯著影響。從已上市 ADC 獲得的有限數據表明，ADAs 對臨床結果的影響很小。Adcetris 有 37%的ADAs 發生率，持續陽性 ADAs 患者的輸液反應頻率較高，導致兩名患者停止治療。ADAs 與Kadcyla 的發生率為 5.3%，ADA 的發展似乎對安全性、PK 和療效沒有影響。在一期研究中，Mylotarg 有一些 ADA 陽性患者，其中一例出現了與 ADAs 相關的短暫性呼吸急促。在目前推薦的劑量方案下，臨床試驗中未生成 Mylotarg 的額

148、外免疫原性數據。在 Besponsa 的臨床試驗中，ADAs 的發生率為 3%，對 ADC 的清除率沒有影響。小結 在 11 個臨床試驗的廣泛的腫瘤適應癥中，8 個 vc-MMAE-ADC 的 ADAs 發生率在 0-35.8%之間。大多數 ADA 反應是針對 ADC 中的 mAb 結構域，這表明半抗原樣結構在產生針對這些 ADC 的免疫應答中只起了非常小的作用。這些結果強化了這樣的事實，即分子結構是生物療法免疫反應的一個重要因素，但不是唯一的因素。盡管這里的 8 個 vc-MMAE-ADC 的數據表明，隨著項目進入臨床開發的后期階段，風險可能會降低，但是對于可能使用不同的接頭和更強力的細胞毒

149、性藥物的新型 ADC，仍然建議采用保守的方法。此外，隨著預測性免疫原性工具的使用越來越普遍，它們將提供額外的信息，以納入 ADC 和新型治療方式的風險評估和免疫原性策略中。58 參考文獻：1.Immunogenicity of antibody-drug conjugates:observations across 8molecules in 11 clinical trials.Bioanalysis.2019 Sep;11(17):1555-1568.59 關于 ADC 治療窗口的新見解 前言 抗體藥物偶聯物（ADC）療法近幾十年來發展迅速，目前全球已有 15 種產品獲得批準，140 多種

150、 ADC 正在臨床試驗中。到 2030 年，ADC 市場將達到 150 億美元以上。ADC 的基本原理：通過將單克隆抗體的特異性與有效小分子藥物的細胞毒性相結合，ADC 可以精確地向腫瘤輸送毒素，同時保留正常組織，增加藥物的治療窗口。臨床前數據表明，將藥物與抗體偶聯可降低藥物的最小有效劑量（MED）并增加藥物的最大耐受劑量（MTD）。但越來越多的臨床證據表明，ADC 的耐受劑量與相關小分子的耐受劑量沒有顯著差異。在細胞毒素含量標準化后，ADC和人體中相應小分子的MTD大致相同。因此，目前人們對于 ADC 治療窗口的一般理解可能是是不準確的。這里我們探討關于 ADC治療窗口的幾個問題，希望能夠提

151、供一些助益，有助于改進下一代 ADC 的設計。ADC 真的能實現比小分子更高的 MTD 嗎？藥物的 MTD 是沒有嚴重副作用（劑量限制性毒性）的最高耐受劑量。過去，確定 MTD是第一階段腫瘤試驗的主要目標。最近，特別是對于新的靶向藥物（包括 ADC），重點放在確定推薦的 2 期劑量（RP2D），它能更好地觀察多個治療周期后出現的慢性毒性和某些 2 級副作用。右圖總結了 10 個已批準 ADC 藥物的 MTD/RP2D 值，通過將 ADC 和小分子劑量轉換為共同單位后，可以標準化分子量和藥物抗體比，更準確地比較 ADC 與有效載荷小分子的治療窗口。結果很明顯，ADC 并沒有顯著提高其有效載荷的

152、MTD，這一認識可能有助于深入了解該領域的幾個現有的觀察結果：（1）具有共同有效載荷-連接子的 ADC 通常會遇到類似的 MTD，因為有效載荷相關的平臺毒性，與靶抗原無關。這突出表明，大多數非靶向不良事件與抗體無關。（2）正常組織中抗體靶向結合產生的靶向非腫瘤毒性是比較常見的。在這種情況下，MTD 可能低于使用相同有效載荷-連接子的其他 ADC。例如，Dato DXd（靶向 TROP2 的DAR4 DXd ADC）未能達到與其他含有 DXd 的 ADC（T-DXd、HER3-DXd、B7H3-DXd 和CDH6-DXd）相同的細胞毒素劑量，這可能是由于與正常組織中 TROP2 表達引起的藥物相

153、關不良事件（皮疹、口炎和粘膜炎）。在用其他 TROP2 ADC 治療的患者中也觀察到對皮膚和口腔粘膜的類似毒性。（3）通過設計限制與正常組織結合的工程化ADC（例如，CX-2009、CX-2029、BA3011、BA3021）與具有相同有效載荷-連接子的常規 ADC 相比，并沒有改善 MTD。60 （4）在一些情況下，降低 ADC 的 DAR 會導致耐受 ADC 劑量的成比例增加，但在細胞毒素量標準化后幾乎沒有改善。例如，與其他 DAR4 MMAE ADC 相比，ALT-P7（DAR2 MMAE ADC）具有類似的 MTD。相應地，B7H3 DXd（DAR4）與其他 DAR8 DXd ADC

154、沒有區別。雖然有點令人驚訝，ADC 之前被廣泛地認為可以拓寬其有效載荷的治療窗口，但從臨床數據可以清楚地看出，MTD 沒有增加。這也得到了近 40 個活躍 ADC 的臨床數據的證實。為什么有效載荷和 ADC 的 MTD 沒有顯著變化？ADC 未能提高其有效載荷 MTD 的原因仍不明確。一種可能的解釋在于抗體在保護有效載荷免受清除和代謝中所起的關鍵作用。有效載荷“全劑量”附著在抗體上，直到 ADC 靶向和非靶向介導的細胞攝取并分解代謝釋放自由有效載荷或有效載荷代謝物，而這些代謝物又通過傳統的小分子途徑被清除。ADC 有效載荷-連接子也可以在血漿或腫瘤微環境中進行細胞外裂解，從而在循環中提供有效載

155、荷的直接來源，而無需內吞。雖然較新的 ADC 使用比前幾代更穩定的連接子，但一些有效的 ADC（包括批準的 ADC）是使用在血漿中半衰期相對較短的連接子構建的。此外，通過硫醇馬來酰亞胺化學制備的 ADC，包括目前批準或正在開發的大多數 ADC，可以使整個有效載荷-連接子從抗體中解偶聯，這一過程稱為逆 Michael 反應。例如，T-DXd和其他 deruxtecan ADC、vedotin ADC 以及許多正在開發中的 ADC。對于這些 ADC，高達50%-75%的有效載荷-連接子在大約 7 天后被解偶聯，解偶聯有效載荷-連接子迅速與含硫醇的血漿分子（主要是白蛋白）反應，形成新的偶聯物。白蛋白

156、在人類中有很長的半衰期，因此，有效載荷不會立即釋放到循環中，而是保持在血液中，直到白蛋白結合物被分解。有效載荷-連接子從 ADC 轉移到白蛋白這個過程可能通過白蛋白偶聯物的非特異性沉積和增加有效載荷半衰期而產生某些毒性。另一方面，它也可能通過白蛋白偶聯物直接被腫瘤吸收從而有助于抗腫瘤效果。然而，由于臨床前模型中白蛋白的生物學特性與人的非常不同，因此對白蛋白在有效載荷-連接子解偶聯相關的毒性和功效中作用的評估仍然難以實現。ADC 的療效是否比其有效載荷有所提高？迄今為止批準的 15 個 ADC 證明了 ADC 治療方法的重要性，DESTINY-Breast03 和DESTINY-Breast04

157、 的最新數據突出了 T-DXd 改變乳腺癌治療模式的潛力。另一方面，100多個終止的 ADC 項目也顯示了選擇抗體、靶點、有效載荷-連接子、DAR 和適應癥的正確組合的挑戰。在 20 世紀 70 年代，FDA 癌癥藥物批準主要基于客觀反應率（ORR），但從 20 世紀 80年代初起，批準基于更直接的臨床療效證據，包括無進展生存率（PFS）和總生存率（OS）的改善。因為 ORR 直接歸因于藥物效應，ORR 也是支持 FDA 加速批準的最常見的替代終點?？紤]到 ORR 通常被用作早期 ADC 試驗的主要終點，這里比較了用于治療類似患者群體時小分子和 ADC 的 ORR。到目前為止，還沒有直接的頭對

158、頭隨機臨床試驗將 ADC 與其有效載荷進行比較。最接近的例子是 DESTINY-Gastric01 試驗中的 T-DXd 在醫生選擇的組中使用伊立替康（與 DXd相同藥物類別的拓撲異構酶 I 抑制劑）治療：T-DXd 治療組的 ORR 為 42%，而醫生選擇組為61 12.5%。有足夠的臨床數據可以得出結論，多個 ADC 顯示出比相關小分子療法更好的 ORR。哪些機制有助于 ADC 的成功？小分子的藥代動力學（PK）通過與抗體偶聯而發生根本性改變。ADC 延長了細胞毒素的半衰期，包括保護其免受腎臟清除。另一方面，ADC 面臨著與其他生物制劑類似的問題，這些包括顯著的非腫瘤靶向攝取和非特異性清除

159、，毛細血管壁有限的外滲，由于腫瘤間質流體壓力增加而導致腫瘤內低擴散，以及“結合位點屏障”現象（抗體結合到其靶點的速度快于其擴散速度，阻止了更深的滲透）。對于單克隆抗體，這些障礙中的一些可以通過增加劑量來克服，但這種策略不適用于 ADC，因為偶聯的細胞毒素決定了 MTD。事實上，據報道，只有不到 1%的 ADC 到達人體腫瘤，其余的 ADC 可能會造成不必要的毒性。因此，單用 ADC腫瘤靶向可能無法解釋相對于相關小分子的療效提高。因此，ADC 可能依賴于其他機制來提高效率，例如有效地延長了循環中有效載荷的釋放?？乖磉_和 ADC 特性影響 ADC PK 和分解代謝，調節有效載荷釋放的速率和位置，

160、進而影響游離有效載荷的血漿水平和腫瘤局部濃度。其中，有效載荷旁觀者活性的程度、偶聯化學和連接子類型是關鍵的設計參數。此外，來自不同腫瘤抗原表達水平患者的近期臨床結果支持了循環有效載荷可產生基線抗腫瘤效應的觀點。例如，許多 ADC 在腫瘤抗原低表達或陰性的患者中顯示出療效?？贵w部分可提高由游離細胞毒素提供的基線活性效力，特別是在抗原高表達的腫瘤中。通過比較腦轉移的 HER2+乳腺癌患者中 trastuzumab、T-DM1 和 T-DXd 的試驗數據發現，在 DESTINY-Breast03 的亞組分析中，T-DXd 和 T-DM1 的顱內 ORR 分別為 64%和 33%，而在單獨試驗中，tr

161、astuzumab 沒有產生客觀反應。完整的血腦屏障（BBB）可阻止抗體滲透，但不會限制小分子，這取決于它們的物理化學性質。與 trastuzumab 相比，T-DXd（易滲透）和 T-DM1（不易滲透）的循環中細胞毒性分解代謝物的傾向性可能為觀察到的抗腦轉移活性差異提供最佳解釋。小結 ADC 的成功證明了將正確的靶點、抗體、偶聯方式、DAR、連接子、有效載荷和疾病適應癥結合起來可以產生顯著的臨床效益。然而，盡管存在廣泛的多樣性，目前的 ADC 并沒62 有顯著增加其有效載荷在多種腫瘤疾病狀態下的 MTD。因此，更好地理解臨床活性 ADC 的作用機制，例如抗體靶向遞送、循環中持續的游離藥物濃度

162、、白蛋白轉移或多種機制的組合、以及 ADC 結構成分及其 PK/PD 之間的相互關系對于設計下一代 ADC 非常重要。參考文獻：1.The therapeutic window of antibody drug conjugates:A dogma in need of revision.Cancer Cell.2022 Oct 10;S1535-6108(22)00445-7 63 第二章 ADC 的藥物開發與評價 ADC 非臨床安全性評價的考量因素 前言 抗體偶聯藥物(ADC)是由靶向特異性抗原的單克隆抗體與小分子細胞毒性藥物通過連接子鏈接而成,兼具傳統小分子化療的強大殺傷效應及抗體藥物的

163、腫瘤靶向性。ADC 由三個主要部分組成：負責選擇性識別癌細胞表面抗原的抗體，負責殺死癌細胞的藥物有效載荷，以及連接抗體和有效載荷的連接子。關于腫瘤學的 ADC 藥物非臨床安全性評估的多種策略已有描述。然而，ADC 的復雜性使其非臨床安全性評價必須基于該藥物的具體情況，同時依賴于相關指南的應用和與監管機構的密切協商。ADC 毒性的關鍵決定因素除了靶向抗原選擇和有效載荷的作用機制外，還包括連接子和偶聯技術與位點的選擇。安全性評估的策略應充分考慮 ADC 每個組分的可用信息。許多已批準或正在開發的用于腫瘤適應癥的 ADC 使用相同的單克隆抗體或細胞毒性藥物，已經產生大量的非臨床和臨床數據，充分利用這

164、些使用相同連接子和小分子毒性藥物的 ADC 的可用信息非常重要。然而，安全性評估不僅應考慮單個組分的可參考信息，而且還應考慮在特定 ADC 的組合中而導致的毒性特征的可能差異，例如發生變化的藥代動力學和組織分布相關的差異。將毒性藥物與抗體偶聯可改變任一組分的活性或賦予可顯著影響安全性的獨特性質，因此，臨床上最相關的毒性數據通常來自于完整 ADC 的研究。動物實驗物種的相關性 為了使非臨床安全性研究能夠充分地表征 ADC 的毒性以支持臨床開發，評估動物試驗物種的相關性和非臨床結果的可用性是至關重要的。這些通常需要檢測 ADC 抗體與動物實驗物種中靶抗原的親和力，以及免疫組織化學染色觀察交叉反應。

165、此外，還應考慮 ADC 其他成分相關的物種差異，例如與小分子相關的的藥理學或連接子穩定性相關的物種差異。與其他藥物和生物制品一樣，還應包括對暴露參數和代謝的比較。BR-96 doxorubicin，是一種靶向 Lewis-Y 抗原的嵌合抗體與 doxorubicin 偶聯的 ADC 藥物，在早期非臨床的毒理學研究中，發現狗與大鼠和猴子不同，對 ADC 的毒性作用敏感，并經歷了出血性腸炎作為劑量限制毒性。研究表明，BR96DOX 和未偶聯的抗體具有相同的劑量限制毒性，表明毒性是由抗體介導的，胃腸活檢顯示抗體與上皮細胞結合并致其受損，可能是由補體激活所致。因此，在人的 BR96 Dox 第 I 期

166、臨床試驗中，劑量選擇基于狗的非臨床觀察，因為狗和人類一樣，都在胃腸道上皮細胞中表達 Ley 抗原。臨床研究中在乳腺癌患者比較了 BR96-DOX 與 doxorubicin 的藥效和安全性，ADC 的療效較低，兩組間毒性差異顯著。服用 BR96-DOX 與 doxorubicin 的典型副作用不相關，但會產生胃腸毒性，包括惡心、嘔吐、胃潰瘍和出血，這些都出現在狗的非臨床研究中。據報道，一名接受 BR96 單抗的患者與接受相應劑量 ADC 的患者一樣顯示胃腸毒性，與狗體內的毒理學數據一致。胃腸毒性被認為是該藥物與表達靶抗原的正常組織結合的表現，這可能64 損害了 ADC 到腫瘤部位的傳遞。因此，

167、開發在癌癥治療中靶向 Lewis 抗原的藥物應努力減少與正常組織的交叉反應。上述案例表明，確定一個合適的試驗物種對于預測在人類中的毒性至關重要，它有助于闡明細胞毒素藥物通過抗體偶聯后的非特異靶向，毒性分布的差異，以及闡明毒性驅動因素，從而指導 ADC 的臨床開發?？贵w靶標的表達 與治療性單克隆抗體的情況一樣，動物試驗物種中缺乏抗原靶點可能會阻礙 ADC 的非臨床評估。ICH S6（R1）生物技術衍生藥物臨床前安全性評價指南（2011 年）指出，“含有新毒素的抗體-藥物/毒素偶聯物（ADC）的物種選擇應遵循與非偶聯抗體相同的一般原則。用于測試單克隆抗體的相關動物物種是那些表達所需表位并表現出與人

168、類組織相似的組織交叉反應譜的物種?！币虼?，物種和疾病特異性可能決定或限制非臨床評估。Polatuzumab vedotin 是一種靶向人 B 細胞上 CD79b 的 ADC，但臨床前研究發現其與小鼠、大鼠或食蟹猴的 CD79b 都不結合，導致缺乏與藥理學相關的非臨床物種。使用與食蟹猴 CD79b 結合的替代 ADC 進行非臨床毒性研究，這是 ICH S6（R1）指南中描述的生物制劑非臨床安全性評估的另一種方法，該替代 ADC 在人 CD79b 的親和力類似于polatuzumab vedotin。替代 ADC 使用與 polatuzumab vedotin 相同的連接子-有效載荷，并且具有相似

169、的藥物抗體比（DAR），但是替代抗體不同于臨床抗體，它是一種具有非人源化的嵌合抗體。臨床前研究需要對替代 ADC 進行充分表征（包括結合表位、活性和效價以及 PK），此外還需要提供對應的 polatuzumab vedotin 的相關藥理學、PK 和安全性信息。藥物和/或抗體的生物活性 盡管 ADC 包含幾種組分，但在大多數情況下，腫瘤適應癥 ADCs 的非臨床和臨床研究中觀察到的嚴重或劑量限制毒性主要是由細胞毒藥物和/或其代謝產物所介導的。例如，周圍神經病變發生在許多使用微管抑制劑的 ADC 中，最突出的是 MMAE。另外，眼部毒性通常由包含 DM4 和 MMAF 的 ADC 引起。FDA

170、對所有申報的腫瘤 ADC 非臨床安全數據的分析發現，ADC 對嚙齒動物和食蟹猴的毒性主要見于造血系統、肝臟和生殖器官。如果有效載荷、連接子、DAR 和給藥頻率一樣，無論抗體靶標或亞型如何，在人體的最大耐受劑量（MTDs）都是相似的。這一點在已獲批的 4 種 ADC 在大鼠和食蟹猴的臨床前研究中觀察到毒性重疊現象一致。在這些 ADC 的非臨床研究中觀察到的毒性通常與 MMAE 或 MMAF 的預期活性一致。enfortumab vedotin 非臨床和臨床研究中觀察到的皮膚和眼睛毒性被認為可能是由 Nectin-4 的靶向介導，另外，belantamab-mafodotin 的眼部毒性與其他 M

171、MAF 偶聯 ADC 一致，MMAF 引起的相關炎癥反應可能是導致動物眼睛毒性效應的原因。此外，在無物種交叉反應的大鼠試驗中細胞毒素相關毒性比有交叉反應的猴子試驗中更明顯，這表明高水平表達的靶標可能延緩藥物相關毒性的出現。最近 FDA 對含吡咯苯并二氮雜卓（PBD），DAR 為 2 的 ADC 數據進行了分析，發現動物和人表現出的毒性主要是由毒素藥物引起的，通過抗體靶點介導的作用不明顯，與之前的結論一致。65 ADC 脫靶相關毒性的機制目前尚不清楚，但除了連接子-有效載荷不穩定導致過早釋放外，還可能通過 Fc 介導和非特異性內吞引起完整 ADC 的抗原非依賴性攝取。在 ADC 相關眼部毒性的研

172、究中，評估了一系列靶向 ENPP3 的 ADC，其中含有 mc-MMAF 或 vc-MMAE。研究結果發現，微胞飲作用在人角膜上皮細胞（HCEC）對 ADC 的內化過程中起著重要作用，這一過程至少部分依賴于 ADC 的生物物理性質（電荷和疏水性）。有趣的是，與 vc-MMAE（AGS-16C3E）偶聯的單抗和與 mc-MMAF（AGS-16C3F）偶聯的單抗在 HCECs 中具有相似的細胞毒性，這表明試驗中的效果與這兩種連接子-有效載荷類型無關。另一種 ADC，抗 RET 單抗（Y078）偶聯 DM1 的毒理研究則強調了所有 ADC 組分的重要性。Y078 以相似的親和力與人和食蟹猴的 RET

173、 結合，組織交叉反應也顯示相似的染色模式，表明猴子是評估靶向效應的合適試驗物種。毒性研究發現，Y078-DM1 和未偶聯的 Y078在較小程度上與劑量依賴性周圍神經病變有關。由于 RET 在成人外周神經系統中表達，這是一種預期的結果，即將有效的微管干擾藥物靶向表達 RET 的細胞。然而，在未偶聯的 Y078中也觀察到神經毒性表明，除了靶向給藥外，抗體也具有一定的作用。MEDI-547，一種由靶向 EphA2 的抗體與 MMAF 偶聯的 ADC，抗體部分與人類、食蟹猴、小鼠和大鼠 EphA2 具有相似的親和力。然而，盡管在 1 期研究中報告的患者凝血異常與非臨床研究中發現的所有三個物種的凝血異常

174、相似，但人類發生嚴重血液毒性的劑量遠低于基于非臨床研究預測的安全劑量，導致臨床研究中止。根據藥代動力學數據顯示，ADC 的有效載荷基本沒有發生脫離，因此，抗體可能是研究中觀察到的毒性的原因。連接子化學 連接子是 ADCs 安全性和有效性的重要決定因素。連接子通常分為可切割型和不可切割型，其設計可在血流中保持穩定，同時允許小分子細胞毒素在靶細胞內吞后有效釋放。連接子在體循環中的穩定性一直是安全性評估的一個關鍵焦點，因為在 ADC 的靶細胞內化之前，小分子的過早丟失可能導致非特異性藥物釋放的靶外毒性。開發具有更穩定連接子并保持更低水平非偶聯單抗，被認為是改善 ADC 藥代動力學特性、治療指標和安全

175、性的關鍵。Mylotarg 的一個很大的問題就是不夠穩定的連接子，但通過優化，后續的 ADC 如inotuzumab ozogamicin 和 milatuzumab doxorubicin 使用類似的不耐酸的腙連接子，在人血漿和血清中顯示出良好的穩定性。然而，將含有腙連接子的 ADC 與使用蛋白酶敏感的二肽連接子的 ADC 進行比較表明，肽連接的 ADC 在緩沖液和血漿中比相應的腙連接物更穩定，因此表現出更特異的傳遞和更低的全身毒性。連接子-有效載荷穩定性的物種差異使在非臨床研究的基礎上評估 ADC 的治療指數變得困難。在小鼠中觀察到的酶促 VC-PABC 裂解，與在大鼠和食蟹猴血漿中檢測到

176、的穩定性形成對比，這種差異歸因于羧酸酯酶活性和底物特異性的物種差異。連接子也會影響 ADC 的物理化學性質，如聚集趨勢，這會影響 ADC 的療效、肝毒性和免疫原性。在使用喜樹堿細胞毒素的 ADC 的開發過程中，將基于葡萄糖醛酸的連接子與二肽連接子進行比較時，親水性更強的葡萄糖醛酸連接子比二肽連接體子產生更少的抗體聚集。該研究還報道抗 Lewis-Y 抗原的二肽連接子喜樹堿 ADC 對小鼠模型中的腫瘤生長沒有影響，而相應的葡萄糖醛酸連接子 ADC 誘導了實質性的腫瘤生長延遲。66 小結 非臨床毒理學研究的目標是預測在臨床中潛在的安全風險。ADC 非臨床安全性研究的預測價值可以通過適當選擇動物試驗

177、物種、了解產生不良反應的機制或 ADC 的毒性驅動因素來提高。腫瘤適應癥 ADC 臨床開發過程中報告的非臨床和臨床毒性結果表明，ADC 的每個組分都可能在觀察到的毒性反應中發揮作用，因此，在設計和解釋非臨床安全性研究時應予以考慮。盡管在大多數情況下，嚴重或劑量限制性毒性似乎主要由小分子介導，但隨著 ADC 領域的發展和擴大，可能會出現不同的模式。參考文獻：1.Considerations for theNonclinical Safety Evaluation of Antibody Drug Conjugates.Antibodies(Basel).2021Jun;10(2):15.67 影

178、響 ADC 藥代動力學的多因素分析 前言 抗體偶聯藥物（ADC）是一種復雜分子，其中單克隆抗體與細胞毒性藥物（小分子有效載荷）通過連接子相連，形成偶聯物。2000 年，美國 FDA 批準了首個 ADC Gemtuzumab ozogamicin（Mylotarg）用于治療 CD33 陽性急性髓細胞白血病。2010 年，由于不良事件，特別是肝臟副作用，Mylotarg 退出市場，隨后于 2017 年又獲得批準。自 2000 年 Mylotarg批準以來，制藥公司一直非常關注 ADC 的開發。ADC 將抗體的選擇性與小分子藥物的療效相結合，從而實現更精確和更有針對性的治療應用。ADC 有三種成分：

179、單克隆抗體、有效載荷和連接子。所有這三個組件在設計 ADC時都非常重要。在現代藥物開發中，藥代動力學（PK）在設計安全有效的劑量以治療疾病方面發揮著重要作用。有幾個因素可以改變藥物的 PK，這些因素包括“內在”和“外在”因素。對于小分子，內部和外部因素的影響都得到了很好的證實。眾所周知，年齡、性別、疾病狀態（如腎和肝損傷）、藥物-藥物相互作用等都對小分子 PK 有影響。而對于大分子來說，這些因素的影響還沒有得到很好的證實。由于 ADC 是與小分子相連的單克隆抗體的組合產物，因此 ADC 的小分子和單克隆抗體可能受到許多內在和外在因素的影響。影響 ADC PK 的內在因素 內在因素是與個人相關的

180、因素。例如，年齡、性別、遺傳學和疾病狀態都是內在因素。而外部因素是來自外部的影響。例如，藥物-藥物相互作用、食物或飲料、吸煙、營養不良及其它環境因素。年齡 以 FDA 批準的 10 個 ADC 為基礎，關于老年人與年輕人之間年齡差異的總體結論是，沒有足夠的數據來確定這兩個年齡組之間的 PK 差異，群體藥動學（POPPK）無法檢測到 PK的差異，兩個年齡段之間沒有臨床意義的 PK 差別。性別和種族 性別對 PK 沒有任何臨床影響，POPPK 無法檢測到 PK 的差異，或者沒有可用信息。EMA指出，“成人群體模型顯示種族對 Mylotarg 的 PK 沒有顯著影響”。以外，應該注意的是，基于種族的

181、樣本量還不足以在 POPPK 研究中確定種族對 Mylotarg PK 的影響。兒科 對于所有 10 個 ADC，FDA 的藥物說明書沒有提供任何關于兒科的 PK 信息。迄今為止，兒科僅進行了兩項 ADCS 的 PK 研究。Buckwalter 等人研究了復發性或難治性 AML 患兒中 Mylotarg 的 PK。使用經驗證的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）方法分析血漿樣本中的抗體部分和小分子有效載荷。兒童年齡為1 至 16 歲，劑量為 9mg/m2。有兩名嬰兒（0-2 歲）、五名兒童（3-11 歲）和七名青少年（12-16 歲）。通過非房室分析評估 PK 參數：嬰兒、兒童和青少年對 Mylot

182、arg 的清除率分別為 30mL/h、60mL/h 和 260mL/h，而成人的清除率為 270mL/h。嬰兒、兒童和青少年的穩態分布體積（Vss）分別為 2.9L、3.9L 和 9.4L，而成人 Vss 為 20L。盡管樣本量較小，但研68 究表明，兒童群體中 Mylotarg 的 PK 隨年齡而變化。此外，Flerlage 等人對 16 名霍奇金淋巴瘤患兒（6-18 歲）進行了 Adcetris 的 POPPK 研究。與成人相比，兒科 Adcetris 的 AUC 和 Cmax 分別低 25%和 11%。年齡對藥物 PK 的最大影響通常發生在較年輕的年齡組（5 歲）。腎損傷 ADC 的有效

183、載荷通常是小分子，根據小分子的經驗，通過腎排泄的小分子在腎臟損傷時會對 PK 產生影響（較高的暴露或較低的清除率）。除 Adcetris 外，其他九個 ADC 未研究嚴重腎損害的影響。在一項研究中，在 1.2mg/kg 劑量的 Adcetris 使用后，對腎功能正常的受試者（n=8）、輕度（n=4）、中度（n=3）和重度（n=3）腎損害患者進行了小分子 MMAE 的 PK 評估。結果顯示，與腎功能正常的受試者相比，輕度、中度和重度腎損傷受試者 ADC 的 AUC 分別低7%、22%和 71%。輕度和中度腎損傷患者的 MMAE AUC 與腎功能正?；颊呦喈?。在嚴重腎功能損害的受試者中，MMAE

184、的 AUC 幾乎是腎功能正常受試者的兩倍。肝損傷 目前，大多數研究是針對輕度肝損傷患者進行的，肝功能正常和輕度肝損傷的受試者之間沒有發現差異。除了 Adcetris 外，沒有關于嚴重肝損傷受試者的數據。在一項研究中，在 1.2mg/kg 的劑量下、對肝功能正常的受試者（n=8）、輕度（n=1）、中度（n=5）和重度（n=10）肝損傷患者進行了 Adcetris 的 PK 研究。結果顯示，肝損害患者 ADC 的 AUC 降低。與肝功能正常的受試者相比，輕度、中度和重度肝損傷受試者的 AUC分別為 57%、65%和 71%。輕度、中度和重度肝損傷患者 MMAE 的 AUC 分別高 3.5、2.2

185、和1.77 倍。與腎損害一樣，如果在肝損害患者中發現 ADC 的有效載荷大量暴露，不應該在中度或重度肝損害患者完全避免使用藥物，從而使患者失去 ADC 的治療益處，而應考慮 ADC 的劑量調整。影響 ADC PK 的外部因素 藥物相互作用研究 除 TRODELVY 外，ADCs 的藥物相互作用研究進行得相當好，并在藥物說明書中進行了描述。對于 TRODELVY，未進行藥物相互作用研究。免疫原性 從 FDA 藥物說明書可以看出，至少九個 ADC 進行了免疫原性研究（Mylotarg 除外）。對于 Mylotarg，歐洲藥品管理局的評估報告表明，在四項臨床研究中，Mylotarg 治療后抗抗體（A

186、DA）的發生率3mg/kg；而隨機偶聯的 ORR 為 30.8%，MTD 為 2.0mg/kg。當將小分子化療藥物與其相應的 ADC 進行比較時，了解兩者之間暴露動力學的差異是很重要的。例如，細胞毒性藥物的全身暴露量以分鐘到小時為單位測量，而 ADC 的暴露量以天為單位測量。因此，對于半衰期為 4 至 5天的 ADC，偶聯毒素的全身暴露量遠高于相應的小分子。此外，小分子有效載荷在其較短的暴露時間窗口內優先分布在高度灌注的正常組織和腫瘤中，導致全身毒性，這通常需要在重復劑量周期內延長數周的恢復期，即“藥物假期”。藥物假期會降低抗癌藥物的療效，并可能導致耐藥性。如果只關注 ADC 及其小分子細胞毒

187、素之間的 MTD，可能會忽略這兩種模式之間的一些基本機制差異。而這些機制可能解釋了它們的療效和 TI 之間的差異。因此，計算 TI 的基于暴露的模型更適合于解釋兩種模式之間的 TI 差異，也更適合于更好地理解 ADC 平臺的改進，并為臨床 ADC 候選者的選擇提供參考。在該模型中，藥代動力學和藥效學（PK/PD）參數基于藥物暴露水平隨時間的變化，例如曲線下面積（AUC）和最大藥物濃度（Cmax），而不是 MTD 或 MED。此外，在基于暴露的 TI 計算模型中，由藥物代謝酶的遺傳多態性、外排泵、藥物相互作用、靶抗原表達差異、體重、疾病或環境等因素引起的藥物暴露的個體間差異也得到了更好的解釋。最

188、后，不同的給藥方案可以為相同的 ADC 產生不同的 TI。例如，應用于急性髓系白血?。ˋML）患者的 CD33 靶向 ADC Mylotarg 的劑量分級方法，其以三個較小劑量給予相同的總劑量可顯著改善總體反應并降低平臺毒性，導致更高的 TI 值。這種分級的劑量方法改善了具有 Cmax 驅動毒性 ADC 的 TI，這不能單純用 ADC 劑量水平來解釋。除了這種有效載荷介導的抗腫瘤活性外，抗體部分還可以通過激活免疫效應細胞，如 ADCC、ADCP 和 CDC作用，提供額外的抗腫瘤活動?？傊?，當應用基于暴露的 TI 計算方法時，ADC 相對于其相應的小分子的優越抗腫瘤活性可以很容易地通過更高的腫瘤

189、內毒素暴露水平來解釋。這種基于暴露的 TI 計算方法將有助于指導未來幾代 ADC 的工程設計，以進一步改善其 TI，使更多的癌癥患者獲益。參考文獻：1.The therapeutic window of antibody drug conjugates:A dogma in need of revision.Cancer Cell.2022 Oct 10;S1535-6108(22)00445-7 2.Therapeutic index improvement of antibody-drug conjugates.MAbs.2023;15(1):2230618.72 73 影響 ADC 療效

190、的關鍵因素 前言 抗體偶聯藥物（ADC）是一種通過選擇性靶向癌癥細胞來克服化療局限性的新興技術。ADC 與抗原結合，特別是在癌癥細胞表面過度表達的抗原，減少了非特異性靶向引起的副作用，并提高了治療指數。理想的 ADC 效力完全取決于幾個物理化學因素，如結合位點、分子量、連接子長度、空間位阻、半衰期、偶聯方法等。目前截止 2023 年 2 月，全球已有15 種 ADC 被美藥物獲批上市，有 100 多種 ADC 正在進行臨床試驗。然而，設計一個理想的 ADC 仍然具有巨大的挑戰性。因此，對 ADC 關鍵成分及其特性的深刻理解將有助于開發安全性更高、治療指數更高的 ADC。ADC 的關鍵組件 AD

191、C 由抗體、連接子和細胞毒性有效載荷組成，ADC 的每個組件都發揮著至關重要的作用。一個理想的 ADC 應該能夠有效到達靶標位置，而不會釋放任何偏離靶標的有效載荷，并且應該能夠在不影響正常健康細胞的情況下殺死癌細胞。為了開發出具有最大有效性的成功 ADC，應考慮所有這些成分，如抗原、抗體、毒性有效載荷和連接子的選擇?？乖x擇 靶抗原有助于區分癌細胞和正常細胞，從而降低非靶向毒性。因此，選擇合適的靶抗原是開發理想 ADC 的第一步。理想的抗原必須具有某些特征，例如，與健康細胞相比，它應該在癌細胞表面過表達；其次，靶抗原應該不具有分泌形式，以避免 ADC 在腫瘤外的結合；最后，靶抗原應該具有內化的

192、效力，以帶入 ADC 的有效載荷。目前，在批準和臨床實驗的ADC 中，血液學和實體瘤最常用的靶點包括 CD33、CD30、CD22、BCMA、CD19、CD79b和 HER2、Nectin-4、Trop-2、EGFR、TF 等?？贵w的選擇 在理想 ADC 中，抗體是與靶抗原特異性結合的關鍵載體，抗體必須具有對靶抗原的高親和力和低免疫原性。此外，抗體應具有維持較長血漿半衰期和快速內化的能力。由于具有最豐富的抗體種類和啟動免疫效應器的能力，IgG 是 ADC 開發中最常見的抗體類型。此外，74 在不同的亞型中，IgG1 是 ADC 開發中最常用的抗體亞型。內化是影響 ADC 療效的另一個主要因素，

193、解離常數（Kd）是影響 ADC 內化進入癌癥細胞的主要因素。理想情況下，Kd 應該較高，以便在整個腫瘤組織中有效滲透并均勻分布。此外，抗體的分子量是影響 ADC 滲透到腫瘤組織中的另一個關鍵因素。由于 IgG 分子量大，ADC 穿透血管并到達腫瘤部位成為一個具有挑戰性的任務。因此，對于理想的 ADC 開發，可以考慮更小尺寸的抗體類型。連接子 連接子作為抗體和有效載荷之間的橋梁，主要有助于 ADC 的穩定性和功效。此外，有效載荷的釋放也主要取決于連接子的類型和性質。理想的連接子應高度溶于水，防止 ADC聚集的形成以及系統循環中有效載荷的過早釋放。通常，ADC 的所有 3 種成分，如抗體、連接子和

194、有效載荷，都可以進行修飾，以獲得穩定有效的 ADC。影響連接字穩定性和有效載荷釋放的三個主要因素是結合位點、空間阻礙和連接子長度。有效載荷 有效載荷是 ADC 的彈頭，是一種具有高度細胞毒性的藥物。理想的 ADC 有效載荷應具有高效力，在系統循環中的代謝或分解代謝過程中具有穩定性，并且具有高溶解性。此外，它應該具有偶聯和膜滲透的官能團。由于溶酶體屏障和腫瘤微環境的復雜性，能夠到達靶點的細胞毒性藥物量非常少，因此，應選擇低 IC50 的有效載荷。如 DNA 損傷劑的有效載荷 IC50 一般在皮摩爾濃度水平，而微管抑制劑在納摩爾范圍。就穩定性而言，有效載荷應對系統循環和制造過程中的任何化學反應保持

195、穩定。如果有效載荷在溶酶體條件下不穩定，則應在細胞表面或進入細胞之前分離有效載荷。ADC 的偶聯方式 偶聯方式和偶聯位點也是設計理想 ADC 的關鍵因素。它可以調節有效載荷釋放的位置和速率，這最終與 ADC 的安全性和功效相關。與內源性氨基酸的偶聯 最常見的偶聯方法之一是利用抗體的賴氨酸殘基，氨基酸親核 NH2 基團與利克有效載荷上親電的 N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）基團發生反應。盡管反應簡單，但可利用賴氨酸殘基的高豐度導致了許多 ADC 在隨機分布下的不均勻混合物的形成。二硫化物重橋接策略 IgG 抗體包含四個鏈間二硫鍵，兩個連接輕鏈和重鏈，兩個位于連接兩條重鏈的鉸鏈區，它們維持著單克隆抗體

196、的完整性。另一個經典的生物偶聯途徑探索了這些半胱氨酸作為有效載荷連接點的作用。四個二硫鍵的還原通常會產生八個巰基，它們能夠與馬來酰亞胺的連接子反應，從而產生 DAR 為 8 的 ADC。聚糖偶聯 由于 IgG 是一種糖蛋白，它在 Fc 片段每個重鏈的 CH2 結構域 N297 位置包含一個 N-聚糖，這種糖基化可以作為連接有效載荷的附著點。多糖與 Fab 區域間遠距離定位降低了在偶聯后損害抗體的抗原結合能力的風險，此外，與抗體的肽鏈相比，它們的化學組成不同，允許位點特異性修飾，使它們成為合適的偶聯位點。75 酶導向修飾 有效載荷的附著可以通過在抗體序列中插入特定的氨基酸標簽以非常有選擇性的方式

197、實現。這些標簽被特定的酶所識別，例如甲酰甘氨酸生成酶（FGE）、微生物谷氨酰胺轉胺酶（MTG）、轉肽酶或酪氨酸酶，從而能夠執行位點特異性偶聯。半胱氨酸工程：硫單抗技術 硫單抗技術通過利用不涉及結構二硫鍵的工程化反應性半胱氨酸，在抗體上實現所需位點的選擇性和均勻修飾。一般來說，半胱氨酸突變的設計是為了促進細胞毒性有效載荷偶聯的同時，保持單克隆抗體的穩定性、親和力和最小化 ADC 聚集。為了確定突變的最佳位置，通常采用幾種技術，包括計算建模、模型系統篩選和高通量掃描。工程化非天然氨基酸 除了硫單抗技術外，非標準氨基酸（ncAA）的加入為位點特異性偶聯提供了另一種可能性。該技術使用含有獨特化學結構的

198、氨基酸，從而能夠以化學選擇性的方式引入連接子-有效載荷復合物。該技術需要對抗體序列重組，利用與宿主細胞內所有內源性 tRNAs 和合成酶正交的 tRNA 和氨基酰 tRNA 合成酶（aaRS），用于響應未賦值密碼子將 ncAA 帶入蛋白質。通常，ncAA 在發酵過程中被添加到培養基中。選擇非天然氨基酸是很重要的，因為它們可能激發免疫原性。常用的 ncAA 是具有獨特基團的天然氨基酸的類似物，如酮、疊氮、環丙烯或二烯。ADC 的挑戰 具有改進策略的新一代 ADC 能夠達到最佳穩定性、特異性，并具有相對較低的脫靶毒性，從而提高治療指數。盡管如此，仍有許多挑戰有待解決，如藥代動力學、靶向特異性有效載

199、荷釋放、抗癌藥物在腫瘤區域的均勻分布、不良副作用和耐藥性。復雜的藥物動力學特征 在 ADC 給藥后，血清中可能存在完整的 ADC、裸抗體、游離形式的細胞毒性有效載荷。在 ADC 的典型藥代動力學特征中，偶聯 ADC 和裸抗體的濃度隨著 ADC 的內化和抗體清除而持續降低。影響 ADC 清除率的兩個主要因素是抗體的細胞毒性有效載荷的去偶聯和通過 FcRn 介導的再循環。游離的細胞毒有效載荷主要在肝臟代謝，通過腎臟（尿液）或糞便排出體外，這可能會導致肝腎功能損害。所有這些因素，再加上患者間高度差異，很難建立 PK 和 PD 模型來描述 ADC 的臨床特征并協助設計新的 ADC。有效載荷釋放 實體瘤

200、的治療比血液學癌癥更復雜。由于 ADC 的高分子量，ADC 很難滲透到腫瘤部位。目前的研究表明，只有一小部分輸入到患者的 ADC 可以到達腫瘤細胞，因此在設計 ADC 時需要考慮有效載荷的效力。不可避免的副作用 與不可避免的副作用相關的最關鍵因素是系統循環中有效載荷的過早釋放，另外，ADC的抗體可能會對身體產生免疫原性副作用。血小板減少癥、貧血、中性粒細胞減少癥、白細胞減少癥和肝毒性是臨床觀察中最常見的毒性。此外，在 HER-2 特異性 ADC 中，觀察到肺毒性，如間質性肺?。↖LD）。因此，應仔細優化下一代 ADC，以開發出副作用最小的 ADC。76 耐藥性 另一個不容忽視的主要因素是耐藥性

201、。目前的證據表明，腫瘤可以通過多種方式產生ADC 耐藥，例如降低抗原表達水平、改變細胞內轉運途徑、對有效載荷的耐藥性。小結 ADC 是一種新興的癌癥治療技術，有潛力克服傳統治療的局限性。然而，ADC 的藥理學非常復雜，設計和合成理想的 ADC 仍然存在一些挑戰。因此，深入了解影響 ADC 療效的因素可以指導開發更好、更高效的 ADC。通過選擇合適的抗原、抗體、連接子、有效載荷以及偶聯技術，從而獲得具有更強效力、安全性和穩定性的 ADC 設計。隨著這個領域中研究人員的不斷努力，不難想象未來的 ADC 將在癌癥靶向治療中展現出更多的驚喜。參考文獻：1.Antibody drug conjugate

202、:the“biological missile”for targeted cancer therapy.Signal Transduction and Targeted Therapy(2022)7:93 2.A comprehensive review of key factors affecting the efficacy of antibody drug conjugate.Biomed Pharmacother.2023 May;161:114408.3.The Chemistry Behind ADCs.Pharmaceuticals(Basel).2021 May;14(5):4

203、42.77 ADC 藥物成功設計的關鍵 前言 抗體藥物偶聯物（ADC）療法近幾十年來發展迅速，目前全球已有 15 種產品獲得批準，140 多種 ADC 正在臨床試驗中。到 2030 年，ADC 市場將達到 150 億美元以上。ADC 的基本原理：通過將單克隆抗體的特異性與有效小分子藥物的細胞毒性相結合，ADC 可以精確地向腫瘤輸送毒素。然而，盡管 FDA 已經批準了多種 ADC 藥物，但在臨床開發過程中，ADC 的失敗率仍然很高。ADC 固有的復雜性是一把雙刃劍，它為提供更好的治療提供了機會，同時也增加了治療失敗的混雜因素。ADC 設計驅動其藥代動力學和藥效學，并且需要比常用的 Cmax 和曲

204、線下面積（AUC）指標更深入的分析，以獲得最佳劑量應用到臨床。目前 FDA 批準的靶向實體腫瘤的 ADC 具有一些共同特征，包括人源化 IgG1 抗體結構域、高表達腫瘤受體和大劑量抗體。這些共同特征對于臨床藥代動力學和作用機制具有潛在影響，并為所有臨床開發階段的 ADC 設計提供了參考。最近批準的 ADC 遵循的 3 個設計標準 最近批準的三種實體瘤 ADC 強調了重要的設計標準。盡管 ADC 的幾個組件顯示出顯著的不同，但其共有特性值得注意。FDA 批準的四種用于實體瘤 ADC 的結構非常不同，包括不同的連接子類型（可裂解與不可裂解、不同的釋放機制、不同的穩定性）、特異性和非特異性結合、不同

205、的靶點、癌癥類型和藥物抗體比（DAR）。有趣的是，這些 ADC 具有三個共同特征：（i）高表達靶點（105106個受體/細胞），（ii）高抗體劑量（3 周內 3.6 mg/kg 或更大劑量），以及（iii）IgG1 同種型抗體骨架。這三個共同特點對藥物的遞送和分配有重大影響。事實上，由于 ADC 使用已知的細胞毒性有效載荷（如微管抑制劑）和已知的靶向抗體，因此其臨床成功的一個關鍵特征就是遞送以可耐受的劑量靶向每個腫瘤細胞的有效載荷。這些共有的設計特征對有效載荷的腫瘤靶向遞送具有各自的影響。高表達靶點 HER2、Nectin-4 和 Trop-2 是高表達的腫瘤抗原，每個腫瘤細胞有超過 105

206、個受體，在健康組織中的表達顯著降低。由于巨大的表達差異，高表達靶點可以提供更大的治療窗口。因為藥物遞送到健康組織通常比遞送到腫瘤更有效，高抗體劑量和高表達腫瘤靶點可以快速飽和低表達健康組織中的攝取，同時仍然最大化腫瘤的攝取。然后可以修改有效載荷毒性和/或 DAR 以確保以高于治療閾值遞送至腫瘤細胞，同時保持健康組織中的亞治療閾值（以避免靶向介導的健康組織毒性）。相比之下，靶向表達較低的腫瘤抗原需要更有效的有效載荷才能在靶向細胞中達到治療濃度。增加有效載荷效力通常會導致更高的毒性，降低 ADC 耐受劑量。而較低的 ADC 劑量會減少腫瘤攝取，但可能不會以相同的量減少健康組織攝?。ɡ?，如果靶向介

207、導的健康組織攝取保持飽和），從而可能降低治療指數。值得注意的是，這種權衡與小分子藥物非常不同，小分子藥物通常與血漿濃度平衡，因此低劑量會導致健康組織的暴露量降低。與小分子形成鮮明對比的是，低劑量更有效的 ADC 可以限制腫瘤的滲透，78 從而降低療效而不是毒性。高抗體劑量 開發針對實體瘤的 ADC 具有很大難度，因為實體腫瘤的血管滲漏、彎曲和淋巴引流不良，導致對流不暢和間質壓力升高。這些特征結合在一起，形成了遞送 ADC 藥物的不利環境。增加抗體遞送和組織滲透的最直接方法是給予更高劑量的抗體，這是當前批準的 ADC之間的第二個共有特征。Kadcyla 是多年來第一個獲得 FDA 批準用于實體瘤

208、的 ADC，2013 年通過使用人 IgG1 骨架、中等 DAR（3.5）、不可裂解連接子和強效微管抑制劑獲得了 FDA 批準。目前的許多針對實體瘤的 ADC 在 3 周內比 Kadcyla 具有更高的劑量（3.75-20mg/kg），顯著超過許多經批準的針對血液瘤的 ADC（例如，Besponsa 和 Zynlonta 的劑量分別為約 0.02 和 0.15 mg/kg）。這些劑量是克服高表達和有效內化所必需，從而將有效載荷遞送到細胞。其他設計標準 有效載荷的選擇對于 ADC 開發至關重要。如今，大多數有效載荷屬于三類之一：（i）DNA 損傷誘導劑、（ii）微管抑制劑和（iii）拓撲異構酶抑

209、制劑。DNA 損傷有效載荷通常是非常有效的（如 PBD），而微管（DM4，MMAE）和拓撲異構酶（exatecan，SN-38）抑制劑則更溫和。確定最佳有效載荷需要逐一分析。較低的有效載荷提供更大的最大耐受劑量（MTD）。然而，對于抗原呈遞量較低的適應癥，有效載荷的遞送量可能不會超過治療閾值，因此需要更高效力的有效載荷。除了效力外，最近的研究還確定了多種有效載荷是免疫原性細胞死亡（ICD）的誘導劑。一些有效載荷在細胞死亡后引起免疫反應的能力是一種新的研究途徑，可能會對下一代 ADC 有效載荷選擇產生廣泛影響。連接子的選擇也非常關鍵，不可裂解連接子在血漿中通常更穩定。目前，連接子化學也取得了顯著

210、的進步。例如，Kadcyla不可裂解連接子在4天內損失18.4%的有效載荷，而Enhertu可裂解連接子在 21 天內損失 2.1%的有效載荷。然而，即使連接子可以減少循環中的 ADC 有效載荷損失，在 ADC 自身的全身吸收和降解之后，也會遇到更困難的挑戰。由于大多數 ADC劑量未到達腫瘤，ADC 將在體內其他地方代謝，在不希望的位置釋放有效載荷。有效載荷、連接子和結合位點都可以影響體內發生非特異性釋放的位置和劑量限制毒性（DLT）。目前 FDA 批準的藥物在這些設計特征中表現出明顯的可變性，表明需要針對其特定靶點個性化設計 ADC。然而，高劑量抗體和高表達靶點的相似性，結合臨床前證據表明，

211、組織滲透和腫瘤飽和度是實體瘤療效的關鍵組成部分。因此，我們需要超越 Cmax 和 AUC，考慮腫瘤組織滲透和腫瘤飽和度，以設計下一代 ADC。腫瘤滲透性 全身藥代動力學、毒性和療效是藥物開發過程中測量的關鍵指標。毒性和藥代動力學可以在早期快速篩除掉一些不好的候選藥物。相比之下，測試療效需要更大的努力，組織滲透在這個過程中發揮重要作用。影響療效的腫瘤組織滲透性不能單獨考慮，毒性同樣重要。例如，在臨床劑量為3.6mg/kg 的情況下，43.1%的 Kadcyla 治療患者顯示出3 級的不良反應。研究者正在研究使用 ADC 的替代給藥方法，以潛在地增加耐受性，如分批次給藥。然而，當審查單次給藥與分批

212、次給藥的 Kadcyla 療效時，分批次給藥的臨床益處降低。因此，減少給藥劑量和增加79 頻率可能更容易耐受，但較小的劑量通常會導致較低的血漿濃度、降低的腫瘤穿透力和較低的腫瘤細胞靶向。腫瘤飽和度 另一個關鍵的方面是腫瘤飽和度。這取決于多種條件，包括劑量（Cmax）、表達（受體/細胞）、內化率和血漿清除率等。腫瘤飽和度的重要性體現在兩個方面：在臨床前模型中使用飽和劑量的可能性更大；而飽和劑量與亞飽和劑量的結果可能相反。首先，給予小鼠的劑量并不總是與臨床耐受劑量相對應。有時會增加劑量，以應對小鼠體內更快的清除率或反應較低的腫瘤模型，或者因為它們在小鼠體內的耐受性更好。這可能導致臨床前模型中的飽和

213、，而臨床耐受劑量可能是亞飽和的。由于小鼠細胞對 ADC 有效載荷的反應通常不如人類細胞，需要大劑量的反應，這些大劑量可能會掩蓋臨床中的遞送問題。第二，飽和劑量下的臨床前研究結果可能會產生與臨床中的亞飽和劑量下相反的結果。例如，如果給予飽和劑量，則增加 DAR 更有效，而當給予過飽和劑量時，降低 DAR 可能更有效。通常，劑量受有效載荷毒性的限制，因此在恒定有效載荷劑量下進行比較。當腫瘤過飽和時，癌細胞接收到最大量的抗體，因此每個抗體具有更多有效載荷將產生更大的療效。對于過飽和劑量，情況正好相反。在這種情況下，ADC 不能到達所有的癌細胞，增加 DAR（以恒定的有效載荷劑量）將降低所遞送的抗體量

214、，從而減少靶向和殺死的細胞數量。相反，在這些條件下降低 DAR 和/或增加總抗體劑量可以提高組織滲透性和總體療效。因此，有效載荷 MTD 應與抗體的飽和劑量相關聯，以實現最大的組織滲透和功效。此外，最近批準的三種用于實體瘤的 ADC 都使用能具有旁觀者效應的有效載荷。旁觀者有效效應可以使有效載荷在釋放后擴散出靶細胞并進入相鄰細胞。理論上，旁觀者有效載荷還能夠提高組織穿透力，超過抗體本身所能達到的水平。這可以解釋 Enhertu 與 Kadcyla相比在 NCI-N87 小鼠模型中表現出的療效增加，盡管細胞效力相似。然而，即使在使用具有旁觀者有效載荷的 ADC 時，較高抗體劑量增加的組織滲透仍會

215、提高療效。盡管旁觀者有效載荷可以改善分布，但抗體直接遞送的效率高于旁觀者殺傷，這解釋了即使有旁觀者有效載荷，較高的抗體劑量也會產生更大的效果。小結 在過去的幾十年里，靶標選擇、連接子穩定性和有效載荷毒性一直是 ADC 藥物設計的主要考量。然而即便如此，由于毒性和/或治療窗口不佳，許多在臨床前研究中看起來很有前途的 ADC 最終在臨床試驗中失敗。通過分析最近 FDA 批準的 ADC 藥物的共有特征，可以發現組織滲透和腫瘤飽和度同樣是 ADC 成功設計的關鍵。因此，在臨床前研究中需要特別關注有關療效最重要參數的數據，包括腫瘤滲透和飽和度。在一個理想的設計方案中，至少有兩條信息是已知的：人體內可耐受

216、的有效載荷劑量和使腫瘤靶點飽和所需的抗體劑量。有了這些信息，我們就可以通過修改DAR 來為所有腫瘤細胞提供最高耐受量的有效載荷，從而在臨床耐受劑量下最大限度地提高療效。80 參考文獻：1.Key metrics to expanding the pipeline of successful antibody-drug conjugates.Trends Pharmacol Sci.2021 Oct;42(10):803-812 81 ADC 設計中的靶抗原選擇 前言 抗體偶聯藥物（ADC）是一種強大的抗癌治療方法，通過靶向特異性抗原的單克隆抗體與小分子細胞毒性藥物通過連接子鏈接而成。ADC 利

217、用抗體對其靶抗原的特異性，結合細胞毒性藥物的效力，選擇性地殺死表達靶抗原的腫瘤細胞。兼具傳統小分子化療的強大殺傷效應及抗體藥物的腫瘤靶向性。在 ADC 的開發中，選擇在惡性細胞上高表達但在正常組織和免疫細胞上低表達的靶抗原被認為是實現選擇性和效力的關鍵，同時最大限度地減少靶向腫瘤外毒性。除此之外，選擇用于 ADC 的抗原需要考慮與靶抗原的表達模式和生物學特征相關的幾個因素。靶抗原選擇的因素 在 ADC 中使用高效細胞毒性有效載荷需要合理的靶抗原選擇，目的是最大限度地提高腫瘤選擇性和抗腫瘤效力，同時最大限度地降低靶向腫瘤外劑量限制毒性。因此，在試圖平衡安全性和有效性等因素的同時，盡可能地向癌細胞

218、遞送有效載荷對 ADC 設計至關重要。根據目前公認的原則，有效 ADC 的理想靶抗原應在腫瘤細胞表面以足夠的密度和均勻性表達，在正常細胞上以最小的表達量表達，以限制靶向腫瘤外毒性并優化治療指數。除了特異性和過表達外，最佳的靶抗原還需要是細胞外的，以便抗體結合抗原表位。此外，ADC療效通常取決于有效的靶向介導內化，腫瘤抗原與 ADC 結合后的內化率和內化溶酶體運輸動力學可能直接影響有效載荷釋放和癌細胞殺傷。了解抗原靶點主要指向循環或溶酶體靶向途徑也是至關重要的?？乖?ADC 復合物再循環到質膜被認為會影響 ADC 向溶酶體的有效遞送，并可能阻礙有效載荷向胞質的釋放，從而損害 ADC 的效力。最后

219、，影響 ADC 有效性的另一個因素是從細胞表面去除抗原的速率，通常由腫瘤細胞產生的蛋白酶介導，這一過程被稱為抗原脫落。靶標表達水平 達到 ADC 活性的抗原表達閾值水平根據幾個參數而顯著變化，其中許多參數尚未完全闡明。已知表達水平取決于特定靶點、識別的抗原表位和癌癥適應癥，這對于靶向實體瘤的ADC 尤其明顯。例如，評估 Kadcyla 對 HER2 陽性轉移性乳腺癌療效的臨床經驗表明，與HER2 低表達亞組相比，高表達亞組的生存率更好。然而，Enhertu 對 HER2 低表達乳腺癌患者的突出療效表明，沒有廣泛適用的靶抗原表達閾值來確保 ADC 的療效。在體外和體內實驗中，一些 HER2 陰性

220、細胞系可能仍然保持活躍的 HER2 信號傳導，并且對抗 HER2 療法敏感。這表明，由于表面表達的 HER2 水平較低，導致的較低水平的促腫瘤信號傳導仍可能支持腫瘤生長。其它的靶點也不盡相同，例如選擇僅高表達 FR靶抗原的患者組似乎與治療益處相關。而在腎細胞癌臨床研究中的 ADC 靶點CD70，僅觀察到抗原表達水平與 CD70 靶向 ADC 敏感性之間的有限相關性?？偟膩碚f，針對 ADC 治療幾種癌癥類型的臨床前研究和臨床評估表明，不存在將抗原表達水平與 ADC 活性相關聯的總體范式。因此，需要根據經驗確定每種腫瘤類型和 ADC 的抗原表達的理想 Cut-off 值。82 脫靶毒性 ADC 治

221、療在臨床上觀察到的毒性最常見是由于脫靶效應，而 ADC 的靶向-靶外腫瘤毒性可能受到靶抗原選擇的影響。為了減輕毒性，還必須考慮靶抗原的生理作用及其發揮這一作用的機制。因此，新 ADC靶標的臨床前毒性研究不僅需要研究靶標在腫瘤和正常組織之間的差異表達，還需要研究靶標的生理功能，以確定潛在的毒性。例如，CD44 抗體 bivatuzumab 與 DM-1 的 ADC 用于治療鱗狀細胞癌的 I 期試驗報告了致命的皮膚毒性，這可能歸因于健康角質形成細胞表達CD44。然而，盡管正常細胞表達靶抗原是一個值得考慮的重要因素，但它并不一定會阻礙 ADC的開發和最終成功。例如，盡管 TROP-2 在一些正常組織

222、中高水平表達，但 Trodelvy 已成功開發并獲得 FDA 的批準，用于治療轉移性三陰性乳腺癌。這表明，對于抗 TROP-2 ADC，與惡性組織相比，正常組織中抗原的表達差異可能足以避免嚴重的毒性。此外，也有人認為，TROP-2 在正常細胞上的細胞內而非細胞表面表達，或在抗體或 ADC 無法接近的導管或腺上皮管腔側等部位的表達，可能起到重要作用?？乖撀?當選擇 ADC 靶點時，抗原的脫落率可能是一個重要的考慮因素。在基于抗體的治療方法中，抗原脫落是指去除細胞表面表達的靶抗原，這一過程通常由蛋白酶介導，作為功能調節的一種手段。早期對免疫毒素的研究表明，抗原脫落的增加可能會減少可用于靶向和腫瘤

223、結合的 ADC 的量，從而損害 ADC 的有效性。然而，其他使用數學和實驗模型的研究表明，高抗原脫落率可能增加還是降低 ADC 的有效性取決于幾個因素，包括 ADC 內吞率、ADC 再循環率和通過腫瘤微環境的外滲率。例如，對于抗間皮素和抗 CD25 免疫毒素的相同模型表明，脫落率的增加會增加前者的效力，但會降低后者的效力。血液腫瘤的 ADC 靶點 對于血液腫瘤，免疫譜系特異性生物標志物如 CD19、CD20、CD22、CD33、BCMA 和CD79 在惡性血液細胞上以高水平廣泛而均勻地表達，因此已被廣泛探索為 ADC 發展的候選靶點。此外，批準的 ADC 的靶抗原在結合后都很容易發生內化，這也

224、是有助于 ADC 療效的一個重要特征。CD33 CD33是一種67kda跨膜糖蛋白受體，是唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素（SIGLEC）家族成員，通常在正常髓系細胞上表達，由于其在 AML 細胞上優先 過 表 達，是Gemtuzumab ozogamicin 的靶點。CD33 的胞內免疫受體酪氨酸基抑制基序（ITIM）調節CD33 的內吞作用，可通過網格蛋白介導的內吞作用（CME）激活內吞作用。83 關于內吞效率，AML 細胞中 CD33 的表達水平與其內吞率之間沒有相關性。CD33 是一種緩慢內化的抗原，此外，CD33 交聯并不能改善內吞作用。對 GO 無響應的 AML 患者可能與CD33 受

225、體內吞的功能低下有關。CD22 CD22 是一種 140 kDa 的跨膜糖蛋白，與 CD33 一樣，它也是 Siglec 家族的成員，并與該家族共享多種結構特征。關鍵的區別在于 CD22 比 CD33 大得多，因為它有多個 Ig 結構域和 ITIM/ITIM 樣基序。CD22 的表達僅限于 B 細胞，CD22 在各種 B 細胞惡性腫瘤（包括ALL）的大多數母細胞中表達水平升高。CD22 通過 CME 進行內吞作用。類天然配體通過 CD22 的結構性快速內吞在細胞內積聚。這些配體在溶酶體中被分類降解，而 CD22 則循環回到細胞表面。此外，CD22 配體誘導的內吞激活細胞內池，補充或增加細胞表面

226、 CD22 的表達水平。因此，CD22 對 ADC 具有良好的內吞特性。CD19 CD19 被認為是一種泛 B 細胞標志物，也是成熟 B 細胞表面多分子復合物的主要信號傳導成分。CD19 的表達在大多數 B 細胞惡性腫瘤中高度保守，此外 CD19 具有快速內化動力學，不會脫落到循環中，使其成為理想的 ADC 靶抗原。CD79b CD79b 僅在未成熟和成熟的 B 細胞中表達，在惡性腫瘤80%的 B 細胞中過表達。CD79a和 CD79b 是兩種非共價結合的跨膜蛋白，介導信號傳導和內吞作用。對于后者，CD79a-CD79b 異二聚體是控制 BCR 內吞的支架。BCR 內吞作用主要由 CME 完成

227、，并由 AP-2 介導。有趣的是，CD79a 直接與 AP-2 的亞單位相互作用，進而激活 CD79b 并導致整個 BCR 復合物的內吞。此外，對于 ADC 來說，CD79a 可以作為單體內化，但 CD79b 卻不能。如果 CD79b 的近端膜酪氨酸（Y195）發生突變，AP-2 與 CD79a 的結合就會被阻斷，內吞也被阻斷。在 18%的活化 B 細胞樣 DLBCL 標本中，Y195 發生突變?？傊?，有證據表明 CD79b 其內吞活性依賴于整個 BCR 復合體的內化，而不是作為單體的內化。BCMA BCMA 或 CD269，也稱為 TNFR 超家族成員 17，轉導誘導 B 細胞存活和增殖的信

228、號。BCMA 的分子量僅為 20.2 kDa，其配體結合的胞外區域具有“臂椅”構象，由六個 CRD 組成。除了多發性骨髓瘤外，BCMA 還表達于許多血液系統惡性腫瘤，如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。然而，關于 BCMA 所利用的精確內吞途徑的知之甚少。與內吞作用有關，唾液酸化是一種調節功能，它可能誘導 BCMA 利用 CME 發生內吞作用。CD30 CD30 是一種 120kda 跨膜糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族。其細胞外部分由六個擴展構象的富含半胱氨酸的結構域（CRD）組成。CD30 在活化的 T 細胞和 B 細胞以及各種淋巴腫瘤（包括霍奇金淋巴瘤和 ALCL）上表達。CD

229、30 不具有內吞作用，相反，它因蛋白水解裂解而脫落，CD30 的脫落由基質金屬蛋84 白酶（MMPs）介導。脫落是 CD30 生物學的一個特征，高濃度的循環可溶性 CD30 可以作為監測腫瘤進展的血清標志物。對于 ADC 的療效，升高的 CD30 循環水平似乎會隔離注射的 ADC，從而減少能夠定位于 CD30 陽性腫瘤部位的 ADC 的數量。因此，缺乏內吞作用的結果表明 CD30 不是理想的 ADC 靶點。實體瘤的 ADC 靶點 設計用于治療實體瘤的 ADC 針對一系列抗原，這些抗原通常包括可能與促腫瘤途徑有關的腫瘤相關膜蛋白或受體。迄今為止，FDA 批準用于治療實體瘤的 ADC 靶向包括 H

230、ER2、TROP2、Nectin-4、FR和 TF。HER2 HER2 是一種 185kda 跨膜糖蛋白，屬于 EGFR 家族。HER2/neu 基因的擴增是已知的人類惡性腫瘤和轉移的驅動因素。由于 HER2 在癌癥中的作用，幾十年來一直被作為治療靶點。HER2 也一直是ADCs 的靶點，T-DM1 和 T-DXT 都被批準用于 HER2 陽性轉移性乳腺癌患者。HER2 的內吞存在多種機制，首先是CME，共免疫沉淀清楚的顯示 HER2 直接與 AP-2 結合，此外，dynasore 能完全阻斷 SKBR3 細胞的 HER2 內吞作用。另外，有研究證明 HER2 可以利用小窩介導的內吞途徑和 C

231、LIC/GEEC 的內吞途徑。TROP-2 Trop2 是一種 46kDa 的單體糖蛋白，具有選擇性過表達、結構性內吞作用和導向溶酶體等特性，使其成為 ADC 的一個非常有吸引力的靶點。Trop2 的內化機制與 CME 有關。此外，Trop2 與多種配體結合，如 claudin-1、claudin-7、cyclin D1 和 IGF1，然而，這些配體都沒有證明在與 Trop2 結合或相互作用時被內化。因此，與正常細胞相比，Trop2 在腫瘤細胞中發生的內吞作用更為強烈，這些都表明 Trop2 是 ADC 的一個很好的靶點。Nectin-4 Nectin-4 是一種 66 kDa 的 I 型跨膜

232、蛋白，其主要作用是促進細胞間的接觸。Nectin-4作為 ADC 靶點很有吸引力，因為研究表明，它在幾種腫瘤類型中過表達，但在正常成人組織中幾乎不存在。目前，沒有發現天然配體或 mAb/ADC 與 nectin-4 的復合物內吞的信息，但是可以借鑒nectin-4 結合病原體內吞的研究。Nectin-4 也是麻疹病毒的受體，研究表明，麻疹病毒通過巨胞飲作用進入 MCF7、HTB-20 乳腺癌和 DLD-1 結直腸癌細胞。病毒進入需要 PAK1，相反，dynamin 抑制劑 Dynasore 對病毒進入沒有影響。此外，表達顯性負性小窩蛋白的細胞并不能消除病毒的內吞作用?；谶@些間接研究，nect

233、in-4 表現出病毒受體所需的強大的內吞活。TF 85 TF（組織因子），也稱為凝血活酶因子 III 或 CD142，是一種具有促凝血活性的跨膜糖蛋白，具有與蛋白水解酶因子 VIIa（FVIIa）復合誘導細胞內信號傳導的能力。TF 被認為通過調節細胞生存、增殖、轉移和血管生成的 FVIIa 依賴性細胞內信號通路促進癌癥進展。由于缺氧誘導的信號傳導，它在各種實體瘤和腫瘤血管系統中上調。這種抗原的內化特性是開發 TF 靶向 ADC 的理想選擇。此外，已報道的 TF-FVIIa 介導的表面 TF 表達誘導的機制，其中 TF-FVIIa 復合物的形成導致 TF 從高爾基體釋放，然后運輸到膜，導致細胞表

234、面 TF 表達增強。如果這種作用可以由抗 TF ADC 誘導，那么這可以允許重復靶向表達 TF 的惡性細胞。FR FR（葉酸受體）是一種膜結合代謝葉酸受體，參與葉酸的細胞內運輸。一旦與葉酸結合，受體-配體復合物通過非經典的脂筏內吞機制內化。FR在卵巢癌、乳腺癌、子宮內膜癌、間皮瘤和肺癌中高表達，而在正常細胞中幾乎不表達，使得該受體非常適合 ADC 靶向。此外，FR被認為通過與葉酸結合來輔助促腫瘤信號傳導，誘導下游效應，如 STAT3 的激活、FR的細胞內轉運以作為促生長途徑的轉錄因子，以及葉酸的細胞內運輸用于 DNA 生物合成。小結 對于 ADC 選擇針對實體瘤和血液瘤的靶抗原，可能需要考慮幾

235、個因素：包括（1）抗原在腫瘤和健康組織中的表達程度；（2）抗原在正常細胞和腫瘤細胞中的生理功能；（3）抗原的內吞特性和內吞機制；（4）抗原是否、在何處以及如何脫落，脫落對 ADC 有效性的潛在影響；（5）抗原循環及其對 ADC 作用機制的影響。深入了解靶抗原的這些屬性，并且仔細考量抗原的選擇可能如何影響 ADC 性能的其他方面，將有助于我們設計用于治療實體瘤和血液瘤臨床安全、有效的最佳 ADC。參考文獻：1.Target Antigen Attributes and Their Contributions to Clinically Approved Antibody-Drug Conjuga

236、tes(ADCs)in Haematopoietic and Solid Cancers.Cancers(Basel).2023 Mar;15(6):1845.2.Impact of EndocytosisMechanisms for the Receptors Targeted by the Currently Approved Antibody-DrugConjugates(ADCs)A Necessity for Future ADC Research and Development.Pharmaceuticals(Basel).2021 Jul;14(7):674.86 ADC 連接子

237、的集成設計 前言 由于有效載荷、連接子和偶聯方法的改進，抗體偶聯藥物（ADC）的發展在過去十年中取得了顯著進展。特別是，連接子設計在調節 ADC 在體循環中的穩定性和腫瘤中的有效載荷釋放效率方面起著關鍵作用，從而影響 ADC 的藥代動力學（PK）、療效和毒性特征。一些關鍵的連接子參數，如偶聯化學、連接子長度和連接子空間位阻都會對 ADC 藥物的 PK 和功效產生影響。因此，在 ADC 藥物的設計中，正確調整連接子的這些重要參數，從而實現 ADC 穩定性和有效載荷釋放效率之間的平衡，才能達到 ADC 藥物預期的效果。連接子設計調節 ADC 穩定性 ADC 在體循環和組織細胞中進行生物轉化，除了抗

238、體代謝和分解代謝外，連接子去偶聯、連接子降解和有效載荷代謝被認為是典型的主要生物轉化途徑。理想情況下，ADC 希望在進入靶細胞之前在循環中保持完整和穩定，已經開發出許多涉及偶聯位點選擇和連接子修飾的方法來增強 ADC 穩定性。通常，可以出于這種目的對每個組件（包括抗體、連接子和有效載荷）進行修改，然而研究表明，調節偶聯位點、連接子長度和連接子空間位阻是更有效的通用方法。通過選擇更具空間位阻的偶聯或附著位點，可以實現由抗體提供的空間屏蔽。另一方面，已經證明，在連接子上引入近端空間位阻的替代化學修飾是提高穩定性的有效方法?？贵w提供的空間屏蔽有助于減少連接子裂解以及有效載荷代謝。例如，位點 HC-A

239、118、LC-K149 和 HC-A14087 提供了增強的 ADC 穩定性，降低了部分溶劑可及性（FSA），對應于偶聯位點周圍增加的空間屏蔽。在此基礎上，通過改變另一個主要因素，即連接子長度，可以通過抗體和有效載荷之間的距離對空間屏蔽的影響來調節 ADC 穩定性。研究發現，較短的連接子相對于較長的連接子，通過將有效載荷進一步固定在抗體的空間屏蔽內，通常會導致更好的 ADC 穩定性。此外，偶聯化學也是影響 ADC 穩定性的重要因素，馬來酰亞胺和二硫鍵代表兩種主要類型的偶聯化學。馬來酰亞胺已被廣泛用作抗體偶聯方式，并與可切割或不可切割的連接子一起使用。因此，根據有效載荷的作用機制，藥理有效成分可

240、以是有效載荷本身或具有部分或全長連接子的有效載荷。對于可切割或不可切割的連接子，有效釋放活性成分可以通過最佳連接子設計實現?；诙蜴I的抗體偶聯最近被開發為一種生成可切割連接子的新策略。對于馬來酰亞胺和二硫鍵可裂解的連接子而言，裂解位點附近產生的空間位阻非常關鍵，可以通過化學修飾來調節偶聯物的穩定性。連接子設計調節 ADC 有效載荷釋放 有效載荷釋放可能是 ADC 內化到細胞后的限速步驟。對于不可切割的連接子，在溶酶體中，抗體被蛋白酶分解或水解為肽或氨基酸（AA）。在這些情況下，產生生物活性分解代謝產物，其中有效載荷在其結構中保留某種類型的肽或 AA，有效載荷溶酶體釋放可能需要一種轉運體。相反

241、，可切割連接子被設計通過酶或化學方式，在連接基團斷裂后自降解，以釋放附著的有效載荷。因此，在這些情況下，有效載荷釋放的速率取決于連接子裂解和隨后的固定步驟。在相同的連接子化學條件下，結合位點會影響有效載荷釋放的動力學。例如，對于連接到 LC-V205、HC-A118、HC-A140 和 LC-K149 位點的連接子，觀察到一系列從快到慢的有效載荷釋放動力學。特別是，HC-A118C 位點的吡咯2,1-c苯二氮卓二聚體（PBD）有效載88 荷釋放（15 分鐘）比 LC-K149C 位點（60 分鐘）快。結合位點直接影響釋放動力學，與單克隆抗體無關。在裂解位點引入空間位阻的化學修飾有助于提高 AD

242、C 穩定性。此外，空間位阻也可能導致有效載荷的緩慢或無效釋放。一個很好的例子是環丁基與環丙基二硫化物連接子之間的比較，環丁基類似物對小鼠有效，而環丙基類似物對小鼠無效。深入研究表明，含有環丁基的分子能夠有效釋放活性 PBD 二聚體，然而，在環丙基類似物中未觀察到二硫鍵連接子斷裂后的自降解，因此，有效載荷并沒有得到有效釋放發揮生物活性。連接子集成設計獲得最佳療效 總體而言，想要獲得最佳的 ADC 需要集成連接子的設計方法。如前所述，這種方法應包括多個參數，包括偶聯位點、連接子長度、連接子化學、可切割/不可切割連接和近端連接空間位阻。如上圖所示，相對穩定性排名為 A1 A2A3 A4 aHER2-

243、ss-PBD TDC。特別是，與 S-S 二硫鍵兩側的 H 相比，CH3 增強的空間位阻提高了 ADC 穩定性：A1A3（LC-K149C），A2A4（HC-A140C）。A4 是最穩定的 PBD-TDC，但在小鼠異種移植模型中，其活性最低?？傮w療效排名順序為 A4A1A3/A2。另一方面，腫瘤中釋放的 PBD 二聚體濃度的排名與觀察到的療效趨勢大致一致（A4A1A3A2）。此外，在同一偶聯位點 LC-K149C 處，aCD22 單甲基 auristatin E（MMAE）的 TDC 穩定性在不同的連接子（B1-B3 的 S-S 與 B4 的馬來酰亞胺）之間相似。然而，當 B4/B2 達到 1

244、00%腫瘤生長抑制（TGI）時，觀察到顯著不同的活性（B1B3B4/B2），同樣與腫瘤內釋放的MMAE濃度（B1B3B4B2）一致。此外，還測試了一系列 aCD22 ss maytansine（DMx）TDC，分別在 LC-K149C（C1-C6）和 S400C（C7-C8）位置對二硫化物連接子進行了不同的化學修飾。療效排名（C3C4/C5/C8C1/C7/C2/C6），與腫瘤中測得的DMx濃度（C3C4/C5/C8C1C7C22 前言 抗體偶聯藥物（ADC）包括抗體、連接子和細胞毒性有效載荷。與傳統化療相比，ADC靶向腫瘤有望減輕全身毒性作用，提供更廣泛的治療窗口和更高的治療指數。在過去的十

245、年里，ADC 在治療實體瘤和血液腫瘤方面逐漸成熟，成為抗腫瘤藥物研究的一個革命性領域。雖然 ADC 的發展取得了顯著的成功，但意外毒性和耐藥性的出現帶來了巨大的挑戰。各種因素導致了普遍存在的臨床困境，特別是實體瘤。這些因素包括：（1）實體瘤的異質性限制了靶向單一抗原的臨床療效；（2）治療壓力誘導抗原下調、表位突變和旁路通路的激活，導致顯著的 ADC 耐藥性；（3）正常組織中的靶抗原表達、連接子不穩定性和其他變量等因素導致脫靶毒性；（4）靶抗原對內化的抗性妨礙了足夠治療效果。因此，抗體、連接子和有效載荷的優化成為下一代 ADC 面臨的挑戰。解決上述臨床挑戰的一種前瞻性方法是將雙特異性抗體（BsA

246、bs）與連接子-有效載荷復合物進行偶聯，從而產生了雙特異性抗體偶聯藥物（BsADCs）。與傳統的 ADC 相比，BsADCs獨特的雙表位/靶點結合模式不僅能夠與實體瘤中共表達的抗原結合以增強選擇性，而且還顯著改善內化。這些獨特的優勢使 BsADC 成為下一代 ADC 領域的一支重要力量。目前，至少 10 種以上的 BsADC 正在進行臨床試驗。BsADCs 的設計不僅僅是“1+1=2”，其結合模式的改變影響整體療效，包括了 BsAbs、連接子和有效載荷的全面協調和優化。BsADC 的設計 目前已知 BsADC 的靶點主要集中在 HER2、EGFR 和 c-MET 上。ADC 的各個成分，包括9

247、2 抗體、連接子和有效載荷都需要獨立的優化，對這些關鍵成分中的任何一個進行微小的修改都會導致臨床特征的實質性改變。因此，在設計未來的 BsADCs 時，抗體、連接子-有效載荷復合物的優化和偶聯策略應被視為相互連接的網絡，需要一種整體的方法。雙特異性抗體 構建 BsADCs 的首要考慮因素在于明智地選擇合適的靶標組合。靶點選擇是 ADC 成功開發的基本前提，對最終治療窗口和全身毒性產生關鍵影響。鑒于傳統 ADC 面臨的普遍脫靶毒性和臨床耐藥性的挑戰，以下標準有助于指導靶點選擇：（1）傳統的靶點選擇在于良好的內化特性、在正常組織上相對低的表達和在腫瘤上的高表達。（2）鑒于實體瘤的異質性，必須確定各

248、種腫瘤亞型和位點中靶點的表達水平，從而促進量身定制的藥物遞送的最佳實施，而不是依賴于單一的“靈丹妙藥”。（3）由于 BsADCs獨特的雙重靶向特性，全面考慮抗原組合的深層效應至關重要。這包括內化、再循環、周轉率、溶酶體降解和固有機制等因素。這些因素的整合對于 BsADC 的有效設計是必不可少的。此外，BsADCs 的主要分類標準之一是它們是否包含 Fc 區。不含 Fc 的 BsADCs 的設計面臨著低穩定性、聚集問題和缺乏偶聯位點等挑戰。另一方面，含有 Fc 的 BsADCs 帶來了額外的優勢，如 ADCC、CDC、免疫吞噬作用和細胞因子釋放，這些共同有助于腫瘤殺傷?？傊?，Fc 區構建的策略包

249、括：（1）Fc 工程化修飾，如 Fc 區域的氨基酸突變和糖基化修飾，這些方法可以幫助減輕與 FcR 結合引起的脫靶毒性；（2）保留 ADCC 和 CDC：雙靶結合模式有利于六聚體的形成，可以增強 ADCC 和 CDC 的作用，提高腫瘤的殺傷效果；（3）保留 FcRn 結合或應用抗體工程有助于提高半衰期和安全性。連接子 BsADCs 中的連接子是抗體和細胞毒性有效載荷之間的關鍵連接，在有效載荷釋放和藥物穩定性中發揮著至關重要的作用。理想的連接子應在血漿中表現出穩定性，同時促進腫瘤中的有效釋放。目前，ADC 中的連接子可分為可裂解和不可裂解連接子。不可裂解的連接體在血漿中具有高穩定性，只能在溶酶體

250、中降解以釋放有效載荷。這種類型的連接子導致較低的脫靶毒性、增加的血漿半衰期和增強的安全性。然而，潛在的耐藥性可能源于內化和溶酶體轉運的障礙?；诓豢闪呀膺B接子的 BsADCs 應專注于進一步優化內化，以及隨后的內體轉運和溶酶體降解。與不可裂解的連接子相比，基于可裂解連接子的 ADC 具有更廣泛的應用?？闪呀膺B接子的主要挑戰在于非特異性釋放引起的脫靶毒性。為了設計溶酶體非依賴性 BsADCs，某些可裂解的連接子（如 Val-Cit 連接子）可以有效促進早期和晚期內體的有效載荷釋放。此外，近年來提出非內化 ADC，化學或酶促切割在細胞外觸發，可以靶向 TME 和血管系統中的抗原，激活旁觀者殺傷效應

251、。有效載荷 細胞毒性有效載荷在很大程度上決定了整體抗腫瘤效果和潛在的不良反應?？紤]到ADC 的低滲透性，ADC 的理想有效載荷需要在納摩爾至皮摩爾水平上表現出高藥效。此外，這些有效載荷應具有足夠的血漿穩定性、低免疫原性和適當的水溶性。最后，有效載荷應具有與抗體偶聯的可用基團。BsADCs 中有效載荷的旁觀者殺傷效應是一個值得討論的關鍵方面。旁觀者殺傷效應是93 指有效載荷在釋放后殺死相鄰非靶向細胞的能力。對于 ADC 的 PK/PD 特性來說，這是一把雙刃劍。雖然旁觀者殺傷效應可以提高 ADC 在異質性腫瘤環境中的整體療效，但它也會在腫瘤周圍的正常組織中造成脫靶殺傷的風險。這種效應依賴于可裂解

252、的連接子和疏水性有效載荷。如果其中一種靶抗原在正常組織（如 c-Met）中具有一定水平的表達，BsADCs 應避免施加具有旁觀者效應的有效載荷?？傊?，BsADCs 的旁觀者殺傷作用有望克服腫瘤異質性、腫瘤屏障和較差的內化。然而，與脫靶效應相關的潛在安全問題需要仔細考慮。此外，新型藥物有效載荷對 BsADC 的開發至關重要。新出現的有效載荷，如 PROTAC、鐵死亡誘導物、寡核苷酸等，有助于 BsADC 領域藥物選擇的擴展。新藥的開發可以顯著豐富 BsADCs 領域的選擇性藥物類型。靶向 HER2 的 BsADC ZW49 ZW49 基于 Zanidatamab，利用鏈間二硫鍵半胱氨酸和蛋白酶可

253、裂解連接子，偶聯 N-?；酋０?auristatin，使其具有良好的耐受性。ZW49 的雙特異性抗體性質有助于更好的內化，其 Fc 區賦予 ADCC、ADCP 和 CDC 效應。該設計解決了表達 HER2 患者的幾個未滿足的臨床需求。臨床前數據表明，ZW49 在不損害 HER2 親和力的情況下表現出強大的腫瘤殺傷作用和良好的耐受性。目前，ZW49 正在進行一期臨床試驗。截至 2022 年 9 月，披露的臨床試驗數據顯示，在表達 HER2 的晚期實體瘤患者中的客觀響應率（ORR）為 31%，而其眼部毒性特征不容忽視（角膜炎為 42%）。MEDI4276 MEDI4276 是一種將曲妥珠單抗的

254、scFv 與另一種抗 HER2 IgG1 抗體 39S 的 N 末端融合的四價 HER2 靶向 ADC。MEDI4276 在治療難治性 HER2+癌癥的小鼠異種移植物模型中顯示出顯著的活性，但在臨床測試時并未表現出良好的療效-安全性平衡。在乳腺癌的患者中，總體 ORR 較低（9.4%），最大耐受劑量（MTD）確定為 0.75mg/kg 每 3 周一次。與ZW49 的安全性相比，MEDI4276 的較低 MTD 可能受到其價態、有效載荷和抗體配置的影響，這表明需要進一步優化。94 靶向 HER2CD63 的 BsADC CD63 是四次跨膜蛋白超家族的成員，表現出廣泛但并不普遍的表達。它主要定位

255、于細胞表面、晚期內體和溶酶體。CD63 在這些細胞區室中的存在使其成為 BsADCs 的潛在靶點，旨在增強內化和溶酶體轉運，最終改善藥物遞送和治療效果。通過將 CD63 低親和力突變臂與來自 HER2 抗體的另一個 Fab 臂結合，產生了靶向 HER2CD63 的 BsAb。該設計利用抗體依賴性受體交聯來增強 HER2 的有效內化并促進溶酶體共定位。隨后，Her2CD63 BsAb 通過 VC 連接子與抗有絲分裂有效載荷 duostatin-3 偶聯。然而，該 BsADC 在低 HER2 腫瘤中觀察到的療效不足，表明有必要進一步優化，包括 DAR 的潛在增強和解決腫瘤異質性。靶向 HER2PR

256、LR 的 BsADC 催乳素受體（PRLR）作為惡性乳腺上皮中的過表達靶點，可以通過自身泛素化和刺激AP2 復合物的募集，有效地介導網格蛋白依賴性的初始內化和溶酶體運輸。95 通過利用“KIH”的方法，設計了具有 HER2 臂和 PRLR 臂的 BsAb。BsADC 通過表面賴氨酸將不可裂解的連接子（SMCC）與 DM1 偶聯，平均 DAR 為 3.324。與高表達的 HER2 相比，細胞表面較低表達的 PRLR 足以導致組成型內化和隨后的溶酶體降解。這表明，即使在低表達的情況下，高周轉表面靶標也可以介導良好的內化和溶酶體降解，以提高 BsADCs 的功效。靶向 HER2APLP2 的 BsA

257、DC APLP2 的細胞內尾部包含重疊的基于酪氨酸的 NPXY 和 YXX 基序。在網格蛋白介導的內吞作用后，APLP2 可以與 AP-2 結合，介導有效的內化并直接導致溶酶體降解。靶向 EGFR 的 BsADC EGFR 是 ERBB 受體酪氨酸激酶家族的一員，在調節上皮惡性腫瘤的基本功能方面發揮著關鍵作用，然而，由于治療壓力誘導的獲得性基因組改變，靶向 EGFR 單抗和 TKI 往往導致臨床耐藥性的出現。BsADCs 有望解決抗 EGFR 耐藥性機制，包括致敏突變和旁路通路的激活。靶向 EGFR 雙表位的 BsADC 為了緩解耐藥性的出現，人們開發了一種針對 EGFR 兩個不同表位的雙特異

258、性抗體。這種雙特異性抗體是通過融合 EGFR 上非重疊表位（9G8 和 7D12）特異性的納米抗體而設計的。96 其中 7D12 破壞了 EGFR 信號級聯，而 9G8 穩定了 EGFR-ECD 的束縛構象，在空間上防止了二聚化。此外，7D12 和 9G8 對不同的 EGFR 突變細胞系表現出效力，對表達野生型 EGFR或表現出西妥昔單抗耐藥性突變的 NIH-3T3 細胞誘導更有效的 CDC 效應。靶向 EGFR 和其它抗原的 BsADCs BL-B01D1 是中國首個進入 I 期臨床的雙抗 ADC，靶向 EGFR 和 HER3，接頭采用其自有的 Ac 接頭，相較于 Mc 接頭具有更好的穩定性

259、，親水性更好，不易聚集；毒素為自有的喜樹堿類似物 ED04。其 I 期臨床用藥安全性較好，未出現藥物相關的患者死亡情況。在安全性較好的 10 例可評估的 NSCLC 末線患者中，ORR 為 60%，DCR 為 90%。目前，已經報道了幾種靶向 c-MET 和 EGFR 的 BsAb，證明其在抑制腫瘤增殖和轉移方面具有協同作用。在 BsADCs 的設計中，仔細選擇合適的表位組合對于避免 c-MET 的完全或部分攪動至關重要。AZD9592 是阿斯利康開發的 EGFR/c-Met ADC，通過可連接 linker 偶聯新型拓撲異構酶 1 載荷，主要解決奧希替尼耐藥。相較于 EGFR，AZD9592

260、 對 c-MET 具有更高的親和力，目的是減少由 EGFR 驅動的正常組織毒性。在 PDX 及耐藥模型中，單藥或聯用奧希替尼均展現出良好的抗腫瘤活性。1231 是 Sutro 和默克子公司 EMD Serono 合作開發的 MUC1/EGFR 雙抗 ADC，采用非天然氨基酸定點偶聯技術，通過可裂解 VC 連接子偶聯 hemiasterlin 衍生物（微管抑制劑），DAR 為 4。臨床前研究顯示，在 ESCC 和 NSCLC 患者衍生的異種移植模型中具有很強的抗腫瘤活性。靶向 MET 的 BsADC 肝細胞生長因子（HGF）-間充質上皮轉化因子（MET）途徑在癌癥從開始到轉移的各種類型和階段的發

261、展中發揮著重要作用。MET 的上調和擴增被認為是抗 EGFR 治療期間的主要逃逸途徑。C-MET 可以與 EGFR 發生交叉反應，對 EGFR 靶向治療產生耐藥性，使抑制 C-97 MET 成為克服 EGFR 耐藥性的可行策略。與傳統的 MET 靶向 ADC 相比，雙表位 METMET-BsADC 的設計提供了克服現有挑戰的創新解決方案。MET 雙抗原抗體具有形成 2:2 抗原-抗體復合物的能力，促進有效的 MET內化和溶酶體轉運。通過將 Maytansinoid 有效載荷 M114 經由蛋白酶可裂解的連接子與靶向 MET 的 BsAb 表面賴氨酸偶聯，REGN5093-M114 產生了 DA

262、R 為 3.12 的 BsADC。臨床前數據表明，REGN5093-M114 顯著抑制 MET 過表達的 NSCLC 細胞的增殖。其目前已啟動一項 I 期、劑量遞增和劑量擴展研究，以評估成年 MET-過表達晚期癌癥患者中REGN5093-M114 的安全性和有效性（NCT04982224）。新型 ADC BsADCs 顯著擴展了潛在靶點和支架的范圍，超出了傳統范式。事實上，BsADCs 提供了一種有效的手段來促進非內化抗原轉化為內化抗原。例如，利用以快速內化為特征的EphA2 和活化的白細胞粘附分子（ALCAM）（一種非內化或緩慢內化的抗原）來產生BsAb。有趣的是，當細胞表面 EphA2 與

263、 ALCAM 的比率超過 0.2 的閾值時，雙特異性抗體表現出有效的內化。相反，當比率低于這一閾值時，內化受到阻礙。MC-VC-pab-MMAF 有效載荷復合物通過半胱氨酸殘基位點特異性偶聯。在 BsADCs 的雙特異性結合的背景下，內化效應可以通過同時靶向相鄰抗原而受到顯著影響，這取決于它們的表達比率。這種能力拓寬了抗原選擇的范圍，可以用于設計 BsADCs 內化較差的類型。這種創新方法為增強某些抗原的內化潛力提供了一種微妙的策略，有助于 BsADCs 靶向更廣泛的腫瘤抗原的多功能性和有效性。各種新技術的引入徹底改變了 BsADC 的生成，呈現出明顯的優勢。另一個顯著的進展是 PEG 偶聯的

264、 BsADC（P-BsADC），其不僅確保了均勻的偶聯產生，而且由于其小分子量和不存在 Fc 片段，表現出高的內吞效率、組織滲透和降低的毒性。98 此外，配體誘導的多個抗體結構域的瞬時結合（LITE）是一項尖端技術，它將生物藥物的半衰期延長優勢與小分子相關活性的精確時間控制相結合。這些創新策略在實現治療效果的同時最大限度地減少脫靶效應方面前景廣闊，代表著 BsADC 技術發展的重要一步。BsADC 面臨的挑戰 BsADC 代表了一種融合 ADC 和 BsAbs 優勢的新型治療類別。然而，其面臨的挑戰依然存在，主要歸因于實體瘤的復雜性，包括異質性、組織學障礙和滲透性差等。必須完善 BsADC的設

265、計策略以克服這些挑戰。拓寬抗體骨架 BsADCs 目前的靶點選擇仍然有些有限，主要集中在 HER2、c-MET 和 EGFR 上。然而，雙特異性策略有可能擴大靶點的范圍，包括那些內化不良或低表達的靶點?？紤]到 BsAbs 類型的多樣性，進一步豐富 BsADCs 的抗原選擇可以使抗腫瘤機制多樣化。有希望的途徑包括基于 T 細胞參與或 PD-L1 靶向 BsAbs 的免疫調節 BsADCs。清除不均勻的偶聯 通過基于官能團的有效載荷的隨機化學耦合來構建 BsADCs 具有異質偶聯的風險。這種異質性可能會破壞雙特異性結合模式，并改變 BsADCs 的物理和 PK 特性。位點特異性結合策略可以產生具有

266、均勻 DAR 的 BsADCs，同質 DAR 不僅提高了藥物遞送的準確性，還確保了治療反應的一致性，使其成為 BsADCs 設計和開發的關鍵考慮因素。需要強調的是，位點特異性結合的基礎在于仔細選擇結合位點，這是影響 ADC 藥物療效的關鍵因素。明確兩個靶標之間的參數 BsADCs 的多價結合模式和參數施加了相互的限制和依賴性。兩個目標之間的設計考慮需要仔細檢查，特別是在親和力大小、表達和價態的變化方面。雙特異性結合模式不僅通過價相互影響，而且通過交叉臂結合影響整體內化。除了親和力之外，癌細胞系表面抗原的表達閾值在決定總體藥物效果方面發揮著關鍵作用。解決這些關鍵點需要全面篩選具有不同親和力的結合

267、臂的組合，以實現最佳的生物活性。99 轉運 BsAbs 可以通過將 BsAb 的初始特異性僅作為第二種特異性的轉運模式的方法進行導航。一個例子是 BsAb 平臺利用低親和力轉鐵蛋白受體攜帶-分泌酶抗體，促進有效通過血腦屏障。已經報道了靶向 CD63、PRLR 和 APLP2 的 BsADCs 顯示出輔助轉運的能力。在這些策略的基礎上，設計 BsADCs 有望熟練地穿越生物屏障并逃避溶酶體降解。解決潛在的安全問題 雖然 BsADCs 致力于增強特異性，從而減輕脫靶毒性和副作用，但以 ZW49、MEDI4276和 BL-B01D1 為例的早期臨床數據表明，其臨床安全性不如預期。脫靶毒性是 ADC

268、相關毒性的主要特征。然而，僅僅依靠 BsAbs 可能無法充分解決減少脫靶毒性。除了抗體創新之外，圍繞連接子-有效載荷復合物的關鍵研究也是必不可少的，包括連接子穩定性、同質偶聯策略、DAR 和旁觀者殺傷效應的考慮。小結 總之，獨特的雙特異性靶向模式的出現為 ADC 領域帶來了新的創新，標志著新一代 ADC的誕生。盡管處于開發的早期階段，BsADC 提供了一種具有相當潛力的新方法。BsADC 對于克服傳統 ADC 面臨的現有臨床挑戰和開發更精確的靶向藥物具有重要意義。除了 BsADC，一系列下一代策略有望為新型 ADC 設計做出劃時代的貢獻。其中包括具有雙重有效載荷的 ADC、免疫調節 ADC、放

269、射性核素 ADC、前體 ADC、ADC 聯合治療和肽-藥物偶聯物。未來需要評估這些策略在新型 ADC 設計中的應用，無論是單獨的還是組合的，這將為推進該領域的發展提供了重要的前景。參考文獻：1.Bispecific antibody drug conjugates:Making 1+12.Acta Pharmaceutica Sinica B.20 January 2024 100 第三章 ADC 的臨床應用與治療策略 ADC 在胃癌治療中的進展與展望 前言 胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，表現出顯著的分子和表型異質性。2020 年胃癌新增病例 1089103 例，死亡 768793 例，是全

270、球第五大常見癌癥和第四大癌癥死亡原因。胃癌的流行病學分布因性別和地理區域而異，男性的發病率是女性的兩倍，東亞和東歐的發病率更高。胃癌通?？梢愿鶕蓚€解剖亞型分類，此外也包括不同的組織學和分子亞型。胃癌發生遺傳畸變的積累，包括生長因子和/或受體的表達、DNA 損傷反應的改變和基因組穩定性的喪失，這些表型為靶向治療提供了各種靶點。目前癌癥治療的有效靶點包括HER2、CLDN18.2、FGFR、VEGFR、TROP2、PD-L1 和 Dickkopf-related protein 1（DKK1）。靶向治療采用小分子激酶抑制劑（阿帕替尼、奈拉替尼、吡咯替尼）、單克隆抗體（曲妥珠單抗、帕妥珠單抗）、雙

271、特異性抗體（ZW25、JSKN003）、CAR-T 療法和抗體偶聯藥物（ADC）。ADC 是由靶向特異性抗原的單克隆抗體與小分子細胞毒性藥物通過連接子鏈接而成,兼具傳統小分子化療的強大殺傷效應及抗體藥物的腫瘤靶向性。ADC 對抗原的識別導致 ADC通過內吞途徑進入細胞內，通過溶酶體降解后，有效載荷以生物活性形式釋放并發揮作用，導致癌細胞死亡。目前，全球已有 100 多種候選 ADC 藥物進行臨床試驗，其中 15 種 ADC已獲批上市。其中，DS-8201a、RC48 和 IMMU-132 已被批準用于晚期胃癌治療。因此，開發新的 ADC 藥物和治療模型很重要，它們可能為選擇有限的晚期胃癌患者提

272、供新的可能性。ADC 在胃癌的治療靶點 目前臨床上批準用于胃癌治療的靶向人表皮生長因子受體 2（HER2）的 ADC 可能無法完全滿足患者的治療需求。因此，越來越多的新靶點正在臨床試驗中被探索和使用。EGFR，HER3，claudin18.2、GCC、TROP2 和 SLC44A4 均在胃癌患者中過表達，已成為 ADC 研究的熱門靶點。HER2 HER2 作為胃癌最早、最成熟的生物標志物，一直是 ADC 靶向治療的重點研究對象。T-DM1 于 2013 年獲得美國食品藥品監督管理局（FDA）批準，用于治療 HER2-陽性轉移性乳腺癌。然而，GATSBY 研究表明，與紫杉烷相比，T-DM1 對

273、HER2 陽性的晚期胃癌患者的 OS和無進展生存期（PFS）沒有益處，這可能是由于這些癌癥中的 HER2 異質性。因此，鑒定胃癌中的異質性表達可能是下一步的研究方向。與 T-DM1 相比，trastuzumab deruxtecan（DS-8201a，T-DXd）由于其較高的膜通透性而表現出強大的旁觀者效應，可以靶向低 HER2 表達和 HER2 異質性胃癌患者。臨床前實驗表明，DS-8201a 通過抑制 ADCC 和 Akt 磷酸化在 HER2 陽性 NCI-N87 模型中表現出抗腫瘤作用。此外，DS-8201a 與吡咯替尼聯合使用可促進泛素化，并增強 T-DXd 在胃癌細胞中的吸收。RC4

274、8（disitamab vedotin），另一種 ADC，于 2021 年獲得中國國家醫療產品管理局的批準，在胃癌患者中顯示出良好的抗腫瘤活性。目前正在進行進一步測試，以評估其治療胃101 癌的療效（NCT05313906、NCT05241899、NCT05980481）。此外，一些未上市的 ADC 也顯示出巨大的潛力，如 ARX788、PF-06804103、XMT-1522和 MEDI4276 等，這些 ADC 也正在進行臨床試驗，以評估胃癌患者的劑量和組合模式。EGFR 和 HER3 MRG003 是中國首個測試的 EGFR 靶向 ADC，目前正在參與一項 II 期臨床研究（NCT051

275、88209），評估其治療晚期胃癌的療效和安全性。EV20/NMS-P945 在涉及猴子的藥代動力學和毒理學研究中顯示出良好的半衰期和穩定性。此外，它在體外的各種腫瘤細胞系中表現出靶向依賴性細胞毒性活性，包括胰腺癌、前列腺癌和胃癌。AMT-562 在源自胃癌患者的低 HER3 表達細胞系和患者來源的腫瘤異種移植物（PDX）模型中產生強烈而持久的抗腫瘤反應。BL-B01D1，一種靶向 EGFR 和 HER3 雙特異性抗體偶聯形成的新型 ADC，正在與 SI-B003 一起試驗，用于治療胃腸道腫瘤，包括胃癌（NCT06008054）。CLDN18.2 CLDN18.2 是一種參與細胞旁緊密連接結構的

276、重要膜蛋白，在正常生理條件下僅在胃黏膜的分化上皮細胞中表達。該蛋白在近 60%的胃癌患者中持續穩定表達。2021 年 3 月，CMG901（AZD0901）被 FDA 批準用于針對晚期實體瘤（胃癌和胰腺癌）的 I 期臨床研究（NCT04805307），在 89 名患者中實現了 33%的客觀緩解率（ORR）和 70%的疾病控制率（DCR）。另一個靶向 Claudin18.2 的 ADC EO-3021（SYSA1801）在 17 名胃癌患者（NCT05009966）中顯示出療效，ORR 為 47.1%，DCR 為 64.7%。此外，其他 ADC 正處于早期研究階段，如 TORL-2-307 和

277、LM-302，它們正在研究CLDN18.2 陽性晚期胃腸道癌癥患者的臨床療效，無論是作為單一藥物（NCT05156866）還是與 toripalimab 聯合使用（NCT05934331）。SOT102（NCT05525286）和 CPO102（NCT05043987）已在胃癌和胃食管交界處癌患者中顯示出初步療效。GCC GCC屬于受體鳥苷酸環化酶家族的成員，在胃腸道的液體和離子穩態中起著關鍵作用，在原發性和轉移性胃腸道癌癥中高表達。其表達水平在結直腸癌中達到約 95%，在胰腺癌、胃癌和食管癌中達到 60-70%。在評估 TAK-264（NCT01577758）的一項人類 I 期研究中，在胃癌

278、、胃食管癌和胰腺癌中觀察到了初步臨床療效。然而，隨后的 II 期研究（NCT02202759）顯示，使用 TAK-264 治療的一小部分患者的臨床益處有限。盡管靶向 GCC 的 ADC 尚未達到最佳治療效果，但由于GCC 在胃癌中的高表達，它們繼續顯示出治療晚期胃癌的巨大潛力。TROP2 TROP2 在多種腫瘤中高表達，并可促進腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移和擴散。TROP2 的高表達通常與生存期縮短和預后不良有關。IMMU-132（sacituzumab govitecan）和 SKB264 都由可切割的連接子和拓撲異構酶 I 抑制劑組成。IMMU-132 在胃癌的活性已在 I/II 期臨床試驗（

279、NCT01631552）中報道。一項正在進行的研究（NCT04152499）評估了 SKB264 作為單一療法，可能使局部晚期不可切除或轉移性實體瘤對標準療法產生耐藥性的患者受益，包括胃腺癌和胃食管交界處腺癌。此外，DS-1062 在幾種表達 TROP2 的異種移植物模型中顯示出抗腫瘤作用，包括 NCI-N87 模型。102 其在晚期/轉移性胃癌患者中的試驗（NCT05489211）正在進行中。SLC44A4 SLC44A4 通常在分泌上皮細胞的頂面上表達，現已被確定為大多數胰腺癌和胃癌中的新型細胞表面靶標。靶向 SLC44A4 的 ADC 藥物 ASG-5ME 的臨床研究（NCT011664

280、90）顯示，15 名胃癌患者接受 1.2 mg/kg 的最大耐受劑量，DCR 為 47%。ADC 胃癌的聯合治療 聯合治療現在是腫瘤學臨床前和臨床研究的核心焦點。將 ADC 與各種療法相結合，有利于改善實體瘤患者的預后。ADC 聯合單克隆抗體治療 幾項正在進行的臨床試驗表明，ADC 與 mAbs 聯合治療可提高各種類型胃癌的療效。一項納入 30 名晚期胃癌患者的試驗（CTR20639）表明，與曲妥珠單抗單藥治療相比，ARX788聯合治療可顯著延長患者的 PFS 和 OS 分別達 4.1 個月和 10.7 個月。在另一項臨床試驗（NCT04014075）中，證明 DS-8201a 可以治療接受曲

281、妥珠單抗治療的晚期胃癌患者，從而導致更高的 ORR 和更長的 OS。在聯合治療取得有希望的結果后，DESTINY-Gastric04 研究（NCT04704934）目前正在評估在接受曲妥珠單抗治療后，將 T-DXd 或 ramucirumab 和紫杉醇（Ram+PTX）聯合治療 HER2 陽性的胃癌或胃食管交界腺癌患者的療效和安全性。ADC 聯合免疫療法 目前，阻斷免疫檢查點抑制劑已成為增強癌癥患者抗腫瘤反應的一種有前景的方法。研究表明，ADC 有效載荷直接誘導樹突細胞活化和成熟，引發免疫原性細胞死亡。此外，ADC結構內的單克隆抗體可以上調 PD-1/PD-L1 的表達，增強免疫細胞浸潤，促進

282、樹突狀細胞的抗原呈遞，最終提高 PD-1/PD-L1 抑制劑的療效。在一項涉及 HER2 表達的局部晚期或轉移性實體瘤患者的試驗中，RC48 與 JS001（PD-1 抗體）聯合使用（NCT04280341）。本試驗報告胃癌組患者的 ORR 為 43%，DCR 為 75%，反應持續時間為 5.1 個月，PFS 為 6.2 個月，mOS 為 16.8 個月。此外，T-DXd 已被證明可以增加腫瘤浸潤 CD8+T 細胞的數量，并增強腫瘤細胞中 PD-L1 和 MHC-I 的表達。該藥物目前正在胃癌患者中單獨或與 durvalumab（一種 PD-L1 抗體）聯合使用，以評估其安全性、耐受性、藥代動

283、力學、免疫原性和初步抗腫瘤療效（NCT04379596）。ADC 聯合其它藥物 對于 HER2 陽性的晚期胃癌，抗 HER2 靶向治療和化療的聯合治療是標準的一線治療，而基于 ADC 的聯合治療目前正在積極研究中。在 RC48-C008 研究（NCT03556345）中，RC48 被用于先前接受化療的局部晚期或轉移性胃癌患者，從而形成了聯合治療方法。研究結果表明，ORR 為 24.8%，PFS 為 4.1 個月，mOS 為 7.9 個月。藥物的選擇會影響 ADC 與靶向表面抗原的結合。例如，pyrotinib 顯著誘導 HER2 受體的內化，增強癌癥細胞對 T-Dxd 的攝取。洛伐他汀是一種降

284、膽固醇藥物，可暫時增加細胞表面 HER2 水平，增強 HER2-ADC 結合和內化。WEE1 是一種調節腫瘤細胞分裂的蛋白質，強效 WEE1 抑制劑 adavosterib 和 T-DXd 的組合顯著增加了抗腫瘤活性，這是因為 Wee1 激酶抑制劑在 G2 期阻滯期間繞過了細胞修復復制應激誘導的損傷的能力，導致 DNA 損傷積累和隨后的有絲分裂破壞。103 小結 ADC 在胃癌治療中備受期待，目前上市的 DS-8201a、RC48 和 IMMU-132 已成為晚期胃癌患者的二線和后線治療選擇。然而，很少有胃癌患者存活下來接受二線或二線治療，因此，有必要進一步探索新的 ADC 藥物和聯合療法作為

285、一線和二線治療。此外，確定最佳的聯合治療和克服耐藥性的方法應在未來的研究中加以解決。偶聯技術和新型連接子或有效載荷的增強可以為下一代 ADC 的胃癌治療提供思路。鑒于腫瘤環境的復雜性，雙特異性 ADC 可能潛在地促進雙重靶點的協同內吞作用，并提高有效載荷進入癌細胞的效率，這也有利于克服耐藥性。未來 ADC 在胃癌和其它實體瘤治療中應有更廣闊的發展前景。參考文獻：1.Antibody-drug conjugates in gastric cancer:from molecular landscape to clinical strategies.Gastric Cancer.2024 Jul 4

286、.104 ADC 靶向葉酸受體治療卵巢癌的策略 前言 卵巢上皮癌（EOC）約占卵巢癌癥發病率的 95%，是全球癌癥婦科死亡率的主要原因。目前對新診斷患者的標準治療是卵巢腫瘤細胞減滅術加新輔助或術后鉑類化療。大多數患者最初對化療有反應，但不幸的是，高達 80%的患者最終會復發，導致患者死亡。血管生成抑制劑（如貝伐單抗）和聚 ADP 核糖聚合酶抑制劑（如 olaparib）為一部分患者提供了一些臨床益處，但只能延緩鉑耐藥性 EOC 的復發。而免疫檢查點抑制劑（如抗 PD1/L1 單克隆抗體）的大規模臨床試驗也未能在 EOC 中提供臨床益處。在過去幾十年中，卵巢上皮癌的 5年相對生存率僅得到有限的提

287、高，從 1995 年的 43%提高到 2018 年的 50%。因此，鉑耐藥EOC 患者的治療選擇非常有限，是一個主要的未滿足的臨床需求。葉酸受體（FR）由 FOLR1 基因編碼，由于其在 EOC 細胞中普遍高表達，是一個有吸引力的治療靶點。目前，第一種 FR靶向抗體偶聯藥物（ADC）-mirvetuximab soravtansine（Elahere）最近已被美國 FDA 批準用于治療鉑耐藥卵巢上皮癌。Elahere 的批準重新激發了人們開發其他 FR靶向藥物治療 EOC 以及其他適應癥的熱情。葉酸轉運蛋白 人體不能合成葉酸，這是真核細胞增殖和分化所必需的維生素，必須從飲食來源獲得葉酸。細胞外

288、葉酸的攝取主要通過三種類型的葉酸轉運蛋白實現，包括還原葉酸載體（RFC）、質子偶聯葉酸轉運蛋白（PCFT）和葉酸受體（FR）。普遍表達的 RFC 是葉酸轉運進入系統組織的主要途徑，而 PCFT 是一種質子偶聯轉運體，負責小腸中膳食葉酸的吸收。RFC 和 PCFT都是低親和力、高通量的轉運蛋白。相反，FR 是高親和力、低通量的轉運蛋白，通過在選定組織中的內吞作用轉移葉酸。FR 家族共有四個成員，包括 FR、FR、FR和 FR，分別由 FOLR1、FOLR2、FORR3 和 FOLR4 編碼。FR、FR和 FR都是糖磷脂酰肌醇（GPI）錨定的細胞膜蛋白，而 FR是一種缺乏 GPI 錨定區的分泌蛋白

289、。FR是研究最多的家族成員，主要在幾種組織的上皮細胞質膜上表達，包括近端腎小管細胞的頂端刷狀邊界膜、視網膜色素上皮、脈絡叢、肺、卵巢、輸卵管、子宮、宮頸、附睪、下頜下唾液腺、支氣管腺和胎盤滋養層的 1 型和 2 型肺細胞。FR主要在胎盤和髓系細胞中表達，包括活化的巨噬細胞、腫瘤浸潤性巨噬細胞以及急性和慢性粒細胞白血病細胞。FR在中性粒細胞和單核細胞中表達。FR在調節性 T 細胞和哺乳動物卵子中高表達。FR的生理和病理作用 105 葉酸（FA）是胚胎發育所必需的營養物質。葉酸缺乏可導致胚胎死亡，包括神經管缺陷和口腔面部異常。孕婦在懷孕前和懷孕期間每天補充葉酸，可顯著降低胚胎死亡率。FR也是維持幾

290、個器官功能所必需的。腎臟中葉酸重吸收的主要轉運蛋白是 FR，在自發性高血壓大鼠（SHR）中，Folr1 啟動子缺失導致腎小管中葉酸重吸收受損，并增加患糖尿病和心血管疾病的風險。在大腦中，FR在脈絡叢中選擇性表達，并促進 5-mTHF 通過脈絡叢的囊泡轉運。FOLR1 基因的突變會導致大腦葉酸轉運不足，從而導致兒童期神經退行性疾病。有人提出，在癌癥中，FR可能作為轉運蛋白通過增加一碳代謝的葉酸鹽來促進腫瘤發生。然而，即使 FR過表達，將葉酸轉運到細胞中的主要途徑也是 RFC。因此，增加葉酸水平不太可能是 FR促進腫瘤發生的主要機制。此外，一旦通過內吞作用進入細胞，FR和相關的 FA 可以激活幾種

291、細胞途徑。FR可以易位到細胞核中，并作為轉錄因子促進幾個基因的表達，包括 Oct4、Sox2、Klf4、Hes1 和Fgfr4。FA 與 FR一起可以與 gp130 相互作用，啟動 JAK-STAT3 通路，這些基因經常與不良的患者結局有關。FR-FA 復合物還與黃體酮受體物理相互作用，促進 ERK1/2 磷酸化。FR還可以通過下調細胞間粘附分子 E-鈣粘蛋白來促進癌細胞轉移。靶向 FR ADC 的藥物開發 ImmunoGen 開發的 Mirvetuximab soravtansine 是第一個靶向 FR表達腫瘤細胞的ADC。它由人源化抗 FR單克隆抗體（M9346A）、可裂解的連接子和細胞毒

292、性分子 DM4 組成。DM4 通過抑制微管動力學發揮強大的抗有絲分裂的作用。2022 年，Elahere 獲得 FDA的加速批準，用于治療 FR陽性、鉑耐藥的復發性卵巢癌（PROC）、輸卵管癌或原發性腹膜癌的成年患者。Elahere 對上皮性卵巢癌的療效已在幾項臨床試驗中作為單藥或與其他抗腫瘤藥物聯合治療進行了研究。首次人體的 I 期研究（NCT01609556）提供了安全性和有效性的初步數據。共有 44 名患者入選，其中兩名 EOC 患者的臨床獲益最大?？陀^有效率（ORR）為 22%，在FR水平最高的患者亞群中觀察到更優越的療效，ORR 為 31%，PFS 為 5.4 個月。在這一結果的基礎

293、上，一項隨機、多中心 III 期研究 FORWARD I（NCT02631876）納入了鉑 FR陽性 PROC，原發性腹膜或輸卵管癌的耐藥性患者，共有 113 名患者被隨機分配接受 Elahere 或化療。Elahere 組的療效（ORR，47%；PFS 6.7 個月）優于常規單劑化療的療效。隨后的臨床試驗探索了組合方法。在 FORWARD II 試驗中，FR陽性 PROC 患者接受 Elahere和貝伐單抗治療。ORR 為 39%，包括 5 個完全應答（CR）和 21 個部分應答（PR）。中位 PFS為 6.9 個月。因此，Elahere 聯合貝伐單抗是有效的，對 PROC 患者具有持久的反

294、應和可控的安全性。此外，Elahere 最常見的治療相關不良反應是腹瀉、視力模糊、惡心和疲勞。這些不良事件大多是輕微的（1 級或 2 級），通過支持性護理很容易控制?；颊咧薪洺０l生可逆性眼部不良事件（AE），主要是角膜病變和視力模糊。這種眼部毒性可能是由 DM4 引起的，眼部毒性的根本原因尚不清楚。MORAb-22，是一種將人源化抗 FR抗體與微管靶向藥物 eribulin 偶聯的 ADC。其 I 期臨床試驗結果顯示，在 22 名 FR陽性晚期實體瘤患者中，MORAb-202 治療 ORR 達 45.45%，CR達 4.5%，PR 達 40.9%。進一步探索的 II 期臨床試驗正在進行中。10

295、6 小結 在過去的十年里，人們對 EOC 分子特征的理解取得了進展。然而，鉑耐藥性仍然是一個主要的臨床挑戰，并使 EOC 成為最致命的婦科惡性腫瘤。血管生成抑制劑和 PARP 抑制劑并沒有顯著提高大多數患者的總生存率，迫切需要創新和有效的治療策略。在這方面，FR已成為開發靶向療法的一種有吸引力且經臨床驗證的候選藥物。FR在癌細胞表面的相對高表達以及 FR將細胞毒性有效載荷輸送到癌細胞中的能力激發了各種治療方式的發展，包括抗體、ADC、CAR-T、疫苗、小分子和葉酸偶聯藥物。目前，Elahere，一種 FR靶向 ADC，已被 FDA 批準用于治療患有 PROC、輸卵管癌癥或原發性癌癥癌的成年患者

296、。幾種有前景的FR靶向治療也正在進行臨床評估。毫無疑問，Elahere 的里程碑式批準將激發人們對開發新的 FR靶向診斷和治療方法來攻克卵巢上皮癌的熱情。參考文獻 1.Therapeutic strategies targeting folate receptor for ovarian cancer.Front Immunol.2023;14:1254532.107 ADC 的聯合治療 前言 抗體偶聯藥物(ADC)是由靶向特異性抗原的單克隆抗體與小分子細胞毒性藥物通過連接子鏈接而成,兼具傳統小分子化療的強大殺傷效應及抗體藥物的腫瘤靶向性。ADC 由三個主要部分組成：負責選擇性識別癌細胞表面抗

297、原的抗體，負責殺死癌細胞的藥物有效載荷，以及連接抗體和有效載荷的連接子。ADC 目前已成為治療血液惡性腫瘤和實體瘤的一類熱門藥物，進行了廣泛的臨床前和臨床研究。然而，與大多數細胞毒性藥物的情況一樣，由于耐藥機制的出現，ADC 作為單一療法產生的客觀反應或臨床益處的持續時間仍然受到限制。因此，ADC 與其他抗癌藥物的組合成為ADC藥物開發的一個重要方向。目前，監管部門已批準了針對血液腫瘤的 ADC 與化療/化學免疫治療的組合，FDA 也授予了 enfortumab vedotin和 pembrolizumab 的突破性療法認定。與 ADCs 組合最有吸引力的藥物是那些對腫瘤細胞或其微環境具有加成

298、或協同作用而沒有不可接受的重疊毒性的合作伙伴。包括抗血管生成藥物、HER2 靶向藥物、DNA 損傷應答劑和免疫檢查點抑制劑（ICIs）的聯合用藥是目前積極研究的方向。ADC 聯合化療 ADC 與化療藥物的最佳組合需要更好地理解獨特的細胞周期相互作用以及細胞毒性伴侶對表面抗原表達的調節。到目前為止，越來越多的臨床前和臨床數據顯示出良好的應用前景，并為指導進一步的藥物開發提供了寶貴的見解。細胞周期相互作用 作用于 S 期并產生 G2/M 期阻滯的 DNA 損傷劑（例如抗代謝藥物、鉑和拓撲異構酶抑制劑）可與微管抑制劑組合?？ㄣK與 mirvetuximab soravtansine、anetumab

299、ravtanine 或luveltamab tazevibulin 在卵巢癌模型中的成功組合，說明了這一概念。在早期臨床試驗中，以 ravtansine 為基礎的 ADCs 與卡鉑或阿霉素聯合治療對鉑敏感和耐藥的卵巢癌患者，以及以 deruxtecan 為基礎的 ADCs 與卡培他濱或順鉑聯合治療胃癌和肺癌患者的療效顯著。給藥時間的設計 給藥時間可能與藥物組合設計相關。微管蛋白聚合是 ADC 內吞機制的關鍵組成部分，DNA 損傷介導的 G2/M 期阻滯可能需要一些時間讓微管破壞物敏化發生。在結腸癌、肺癌和乳腺癌模型中的研究很好地證明了這一點，連續給藥 SGN-15（Lewis Y 抗原-dox

300、orubicin）和紫杉醇比同時給藥引起更多的 DNA 碎片。這一觀察表明，調整給藥時間，特別是抗微管108 藥物之后延遲給與 DNA 損傷劑，可能會提高治療效果。表面抗原的調節 化療藥物可以調節 ADC 靶向的表面抗原的表達。在這方面，吉西他濱已被證明可以上調胰腺腺癌細胞中 HER2 的表達，其中吉西他賓和 trastuzumab emtansine 的組合發揮了增強的效力。與上述細胞周期相互作用交織在一起，HER2 上調尤其發生在 G2/M 群體中，這是吉西他濱介導的 DNA 合成抑制的結果。重疊毒性 ADC 本質上是化療，因此聯合方案的療效提高往往會受到不可接受毒性的阻礙。主要毒性由細胞

301、毒性有效載荷代謝產物驅動，在設計組合策略時必須仔細考慮。這些毒性包括MMAE 和 DM1 衍生物引起的周圍神經病變、MMAF 和 DM4 引起的眼毒性、DM1 或拓撲異構酶抑制劑的胃腸道效應、或 calicheamicin 衍生物引起的肝毒性，以及幾乎普遍的中性粒細胞減少癥和血小板減少癥。兩項 2a/b 期研究證明了這一點，這兩項研究調查了 trastuzumab emtansine 與多西紫杉醇或紫杉醇聯合治療 HER2+晚期乳腺癌癥，其中一半以上的患者需要減少劑量或停止紫杉烷。新的、更具腫瘤選擇性的 ADC 藥物，如 mirvetuximab soravtansine 和 datotoma

302、b deruxtecan 顯示出更溫和的毒性，使其成為具有不同作用機制的化療藥物的理想伴侶。ADC 聯合靶向藥物 與標準化療相比，ADC 的治療指數有所提高，對選擇性腫瘤群體的活性也有所提高，這使其成為靶向藥物的理想合作伙伴。人們可以設想各種組合策略，以克服治療耐藥性和克隆異質性，引發對癌基因依賴性信號通路的更強抑制，增加表面抗原的可用性并使低抗原表達腫瘤敏感，調節腫瘤微環境。用 ADC 替代化療 到目前為止，許多研究試圖用 ADC 替代標準化療，作為靶向藥物的組合，但結果令人失望。KAITLIN、KRISTINE 和 MARIANNE 等臨床試驗是基于與 trastuzumab emtans

303、ine 聯合pertuzumab 的協同抗腫瘤活性而設計的，然而在新輔助和轉移環境中，與紫杉醇、曲妥珠珠單抗和帕妥珠珠單抗相比，其并沒有顯示出增強的療效。同樣，在卵巢癌中，聯合貝伐單抗，anetumab ravtansine 的療效低于紫杉醇。酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）通過添加 TKI 的雙靶點阻斷可以提供更大的選擇性，并可能改善治療指數。在 TEAL 研究中，與標準的紫杉醇、trastuzumab和pertuzumab聯合用藥相比，trastuzumab emtansine、泛-HER2 抑制劑 lapatinib 和白蛋白結合性紫杉醇聯合用藥在 HER2+乳腺癌患者的新輔助治療中的反應有

304、所改善 Trastuzumab emtansine 和 tucatinib（一種更具選擇性的抗 HER2 TKI）的組合，在既往紫杉烷和 trastuzumab 治療后進展的晚期患者中實現了 47%的客觀應答率（ORR），包括腦轉移患者中 36%的腦特異性應答率。新一代 ADC 和 TKI 可能會獲得更好的結果。靶向 ADC 耐藥 越來越多的證據支持靶向藥物可以同時靶向已知的 ADC 耐藥機制。例如，由于 HER2對乳腺上皮細胞的惡性轉化依賴于細胞周期蛋白 D1，CDK4/6 抑制劑已在 HER2 耐藥患者中109 與 trastuzumab emtansine 聯合使用。此外，另一種關鍵的細

305、胞周期調節因子 PLK1 最近被確定為獲得性和原發性 trastuzumab emtansine 耐藥模型中的上調靶點，其抑制劑 volasertib可使 trastuzumab emtansine 在體外和體內再增敏。另一方面，ADC 也可能是調節靶向藥物耐藥機制的有效組合。例如，osimertinib 和 trastuzumab emtansine 的聯合用藥產生了額外的抗腫瘤作用，其中 trastuzumab emtansine 能夠延遲或克服 EGFR 突變非小細胞肺癌模型中 osimertinib 的耐藥性。表面抗原的調節 一些 TKI 已被證明可調節表面抗原，可能促進進一步的 AD

306、C 活性，并使低抗原表達腫瘤敏感。在這方面，lapatinib,neratinib,tucatinib,和 poziotinib 已被證明可提高 trastuzumab emtansine 的療效。然而，具體的機制原理仍不明確。其中 lapatinib 通過強烈的轉錄上調和減少泛素化增加 HER2 豐度，neratinib 通過刺激內化和內吞作用降低表面 HER2 豐度，tucatinib 對細胞表面 HER2 的影響仍然難以捉摸，而 poziotinib 上調外顯子 20 突變，但不上調野生型 HER2，這表明協同機制與表面 HER2 密度無關?？寡苌?抗血管生成劑可促進 ADC 穿透和

307、腫瘤細胞暴露。anetumab ravtansine 或 mirvetuximab soravansine 與貝伐單抗在卵巢癌癥臨床前模型中的聯合應用具有完全響應的有效性。最近的一項 1b 期研究將 mirvetuximab soravtansine 和貝伐單抗聯合用于重度預處理、鉑耐藥、FR高的卵巢癌癥患者，其中 39%的 ORR 超過了關鍵 AURELIA 試驗的基準值（27%）。DNA 損傷反應劑 通過將靶向 DNA 損傷反應（DDR）的藥物與攜帶 DNA 損傷劑的 ADC 相結合來開發合成致死，可能是治療基因組不穩定腫瘤的一種有前途的策略。傳統上，DDR 藥物與化療的結合受到無法耐受毒

308、性的阻礙，而攜帶拓撲異構酶 I 抑制劑有效載荷的新一代 ADC 的優越活性和耐受性使其更適合作為搭檔。多個臨床試驗正在探索這一策略，包括 niraparib 和 trastuzumab duocarmazine、talazoparib 和 sacituzumab govitecan，以及 olaparib 和 trastuzumab deruxtecan。除了 PARP 抑制外，ADC 對化療的選擇性增加無疑將擴大可組合 DDR 藥物的范圍，例如，ATR 抑制劑 berzosertib 聯合 sacituzumab govitecan的臨床實驗目前正在進行中（NCT04826341）。ADC

309、聯合免疫療法 免疫療法和 ADC 的組合策略最近已進入臨床實驗。盡管臨床前數據和早期臨床研究的結果表明抗腫瘤活性增強，但支持該方法優于標準治療的隨機臨床試驗結果仍在等待中?？?PD-1/PD-L1 和抗 CTLA-4 抗體 越來越多的證據表明，ADC 可能會提高免疫治療劑的療效。所涉及的機制是多種多樣的，以及增強免疫記憶和免疫調節蛋白（如 PD-L1 和 MHC）的表達。一些 ADC 在具有完整免疫系統的臨床前模型中表現出更大的效力，支持其免疫調節功能的相關性。多種HER2靶向ADC，包括trastuzumab emtansine,trastuzumab deruxtecan和disitama

310、b vedotin,已在體外和體內與 ICI 聯合測試，證實了與增強的歸巢和免疫效應物激活相關的協同活性。KATE2 研究是唯一一項公開發表的檢測 ADC 加 ICI 的隨機試驗，該研究比較了預治療 HER2+乳腺癌患者中 trastuzumab emtansine 聯合 atezolizumab 對比 trastuzumab 110 emtansine 聯合安慰劑的療效。聯合治療未能改善無進展生存期（8.2 vs 6.2 個月，P=0.33），表明在 HER2 靶向治療同時添加 ICI 可能僅對 PD-L1 陽性人群有益。盡管在這項隨機試驗中觀察到令人失望的結果，但在多種腫瘤中臨床探索仍在進

311、行。此外，越來越多的臨床前證據表明，組合療法可能會恢復免疫敏感性。例如，在 ICI 難治性黑色素瘤和非小細胞肺癌（NSCLC）患者模型中，AXL 特異性 ADC enapotamab vedotin與抗 PD-1 抗體聯合進行了測試，其中 ADC 通過誘導 T 細胞浸潤和增強抗原提呈，增強了ICI 活性并導致 TME 中的促炎性變化。ADC 聯合其他免疫療法 Polatuzumab vedotin 已被證明通過增加 AKT 和 ERK 信號增強腫瘤細胞上 CD20 的表達，支持其與抗 CD20 抗體（例如利妥昔單抗）和 CD20/CD3 雙特異性抗體療法的聯合。此外，ADC 和免疫調節劑的組合

312、也正在其他疾病中探索，如多發性骨髓瘤。在臨床前模型中，belantamab mafodotin 與 OX40 激動劑的組合產生了協同抗腫瘤活性，增加了腫瘤內 T 細胞和樹突狀細胞的浸潤和活化。臨床上正在積極研究 belantamab mafodotin 的組合方案，如 DREAMM-5 研究（NCT04126200），該研究與多種免疫治療劑包括（抗 ICOS 抗體、OX40激動劑以及-分泌酶抑制劑）以及抗 PD-1 抗體聯合給藥。初步結果表明，聯合抗 ICOS 抗體在重度預處理患者中具有良好的活性。此外，ADC 的設計不僅可以針對癌癥細胞，還可以調節 TME 的元素，如免疫細胞或成纖維細胞，從

313、而改變免疫反應性。例如，靶向 CD73 的 ADC 顯示出令人鼓舞的臨床前活性。此外，在臨床前模型中與 pembrolizumab 聯合使用時，靶向癌相關成纖維細胞的 ADC 顯示出增強 CD8+T 細胞介導的抗腫瘤活性。小結 作為單藥的 ADC 已證明具有抗腫瘤功效，并在多種實體瘤和血液瘤中獲得了批準。學術界和工業界目前正在進行廣泛的努力，通過確定新的靶點和增強其藥理作用來開發下一代ADC，以及基于目前 ADC 的聯合療法。然而迄今為止，使用第一代和第二代 ADC 的組合方法成功有限，這可能歸因于幾個因素，例如靶點的非特異性表達導致正常組織中的不良反應、重疊毒性、不同腫瘤克隆中的療效不足以及

314、新出現的抗藥性機制。因此，需要深刻了解 ADC 的藥理學以及相關的預測性生物標記物組合，在特征良好的患者衍生異種移植模型中進行臨床前評估，從而選擇最有前途的基于 ADC 的組合。相信未來基于 ADC 的聯合療法將展現出光明的前景。參考文獻：1.Antibody-drug conjugates:in search of partners of choice.Trends Cancer.2023 Feb 4 111 HER2 靶向 ADC 的新發展策略和挑戰 前言 人表皮生長因子受體 2（Her2）是酪氨酸激酶的跨膜受體，是表皮生長因子受體（EGFR）家族的一員，該家族還包括 Her1（EGFR）

315、、Her3 和 Her4。所有四個成員都是通過配體依賴或獨立的同源或異源二聚化的活性形式調節細胞增殖和分化。然而，與其他三個成員不同的是，Her2 是唯一一個可以與任何其他成員形成二聚體，從而觸發調節細胞增殖和存活信號通路的受體。Her2 靶向治療顯著地改善了 Her2 陽性乳腺癌患者和胃癌患者的預后。目前，已批準幾種抗 Her2 靶向藥物用于乳腺癌的治療：trastuzumab 和 pertuzumab，兩者均為抗 Her2 人源單克隆抗體，聯合化療被批準為轉移性乳腺癌的一線治療?？贵w偶聯藥物（ADC）結合了小分子藥物的強大細胞毒性和單克隆抗體的選擇性以及良好的藥代動力學特征，Her2 靶向

316、ADC 成為治療 Her2 陽性癌癥非常有前景的方向。Her2 靶向 ADC 的研究現狀 截止 2021 年，有 30 個靶向 Her2 的 ADC 藥物處于臨床階段，其中 23 個仍在取得良好進展，已有三家獲準上市。T-DM1（Kadcyla）是第一個被 FDA 批準用于治療晚期HER2+乳腺癌的 Her2 靶向 ADC 藥物，同時也被批準用于新輔助治療后殘存病灶的早期高?；颊?。2019 年，T-DXd（DS-8201；ENHERTU)成為第二個獲批的新型 Her2 靶向 ADC藥物，它在治療難治性 Her2+轉移性乳腺癌患者中顯示出顯著的抗腫瘤活性。另外，2021年榮昌生物的 RC48 在

317、中國獲準上市，用于治療至少接受過 2 種系統化療的 Her2 過表達局部晚期或轉移性胃癌患者。此外，有七個 Her2 靶向的 ADC 被宣布終止臨床試驗。這些數據顯示，靶向 Her2 的 ADC 的臨床失敗率相對較低（23.3%），表明 Her2 是 ADC 非常理想的靶點。112 Her2 靶向 ADC 的有效載荷 到目前為止，ADC 最常見的有效載荷是細胞毒素，在很長一段時間里，只有少數幾種細胞毒素被用作 ADC 的有效載荷。隨著該領域競爭的日益激烈，超過 10 種新的細胞毒素被用作 Her2 靶向 ADC 的有效載荷，這些 ADC 正在臨床前或早期臨床試驗中進行評估。靶向微管的有效載荷

318、微管蛋白抑制劑，尤其是 Auristatin 和 maytansine，在臨床試驗中被用作大多數 ADC 的有效載荷。這些細胞毒素在紡錘體形成過程中靶向并抑制動態微管，然后進一步誘導有絲分裂細胞凋亡。auristatin 的典型代表是單甲基 auristatin E（MMAE），maytansine 的典型代表是 DM1，MMAE 和 DM1 是臨床試驗中常用的 Her2 靶向 ADC 的有效載荷類型。靶向 DNA 的有效載荷 DNA 靶向劑，如卡奇霉素、杜卡霉素和吡咯苯二氮雜卓（PBD），可以通過共價鍵不可逆地附著在 DNA 的小凹槽上，從而破壞 DNA 的空間結構，進而導致細胞死亡。與只殺

319、死有絲分裂期腫瘤細胞的微管蛋白抑制劑不同，DNA 靶向劑可以作用于增殖和非增殖細胞。杜卡馬嗪是杜卡霉素的衍生物，與曲妥珠單抗偶聯形成一種名為 SYD985 的 ADC，其在乳腺癌中的抗腫瘤活性已在臨床試驗中得到闡明。PBD 二聚體對許多腫瘤細胞具有異常強大的活性，引發了人們對 ADC 開發的熱情。然而，評估 ADCT-502 和 DHES0815A（與 PBD偶聯）在 Her2 陽性乳腺癌患者中的藥代動力學、安全性和耐受性的臨床試驗因療效差和安全性問題而終止。靶向 DNA 拓撲異構酶 1 的有效載荷 喜樹堿及其類似物是一種有效的拓撲異構酶 1 抑制劑，已成為 ADC 的潛在有效載荷。DS-82

320、01a 已經獲得 FDA 的批準，它將 DX-8951f 衍生物與曲妥珠單抗偶聯，DX-8951f 是一種喜樹堿類似物，其抗腫瘤活性高于其他喜樹堿衍生物。此外，sacituzumab 和 labetuzumab 是分別針對 TROP2 和 CEACAM5 設計的 ADC，它們采用 SN-38 作為有效載荷。SN-38 是半合成喜樹堿，是伊立替康的活性代謝產物。盡管SN-38 遇到了一些挑戰，例如高疏水性和有限的有效結合位點，但 Trodelvy 的獲批意味著SN-38 類似物可以滿足 ADC 有效載荷的標準。其他新型有效載荷 除了上述三種類型的有效載荷外，在臨床前試驗中還研究了幾種新的有效載荷

321、。例如，MT-5111 是一種臨床開發中的新型 Her2 靶向 ADC，它結合 Her2 上不同于 trastuzumab 或pertuzumab 的表位，使用核糖體抑制劑志賀毒素作為有效載荷。BDC-1001、SBT6050 和 NJH395 選擇 Toll 樣受體（TLR）激動劑作為有效載荷，以刺激強烈的局部抗腫瘤免疫反應，正在表達 Her2 的實體瘤患者的 I 期臨床試驗中進行評估。MM-302 利用了細胞毒性化療脂質體阿霉素，臨床前研究表明其活性優于蒽環類藥物和脂質體阿霉素，但在 II 期試驗中未達到終點。Her2 靶向 ADC 的連接子 為了成功地連接抗體和有效載荷，ADC 的連接子

322、構建必須滿足一些關鍵標準。首先，連接子必須足夠穩定，在血液循環中不會過早斷裂，這可以有效避免 ADC 的靶向毒性。其次，113 一旦 ADC 被內化到靶細胞中，連接子還允許從抗體分子有效釋放高度細胞毒性的有效載荷。第三，為了抑制 ADC 的聚集，還對 CMC 提出了重大挑戰，必須考慮連接子的疏水性。連接子分為兩類：不可切割型和可切割型。大多數 ADC 連接子采用可切割連接子，可通過環境（如低 pH 值）或特定溶酶體酶（如組織蛋白酶 B）條件性的切割。含有二肽的連接子依賴于組織蛋白酶 B，組織蛋白酶 B在多種惡性細胞中過表達，其具有羧基肽酶活性，并選擇性識別某些氨基酸序列，以在序列的 C 端切割

323、二肽連接體，如 Phe-Lys、Val-Cit、Glu-Val-Cit 和 GGFG。許多 Her2 靶向ADC 采用了酶裂解型可切割連接子，如 SYD985：DS-8201a：RC48：另外一些 ADC 利用不可切割的連接子在有效載荷和抗體之間構建比可切割連接子更穩定的偶聯。帶有不可切割連接子的 ADC 通常具有更復雜的藥物釋放機制，依賴于抗體的完全蛋白水解降解，由于滲透性差只具有有限的旁觀者效應。這類Her2靶向ADC例如T-DM1：114 BAT8001：和 ARX788：Her2 靶向 ADC 的偶聯技術 目前，臨床試驗中 Her2 靶向 ADC 的主要偶聯策略是半胱氨酸偶聯，如 RC

324、-48 和SYD985，其次是賴氨酸偶聯。此外，近年來，與抗體上的工程氨基酸或天然氨基酸進行位點特異性偶聯成為一種趨勢，例如 ARX788 和 A166。賴氨酸偶聯 115 最常見的偶聯方法之一是利用抗體的賴氨酸殘基，氨基酸親核 NH2 基團與有效載荷上親電的 N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）基團發生反應。這種技術已成功應用于批準的首個 Her靶向 ADC，即 T-DM1。然而，典型的 IgG1 抗體有 80 到 90 個賴氨酸殘基，其中約 10 個可以在強制條件下進行修飾。賴氨酸殘基上的偶聯導致 ADC 藥物抗體比（DAR）的異質性。此外，連接子可能會附著到一些在抗體-抗原相互作用中至關重要的賴

325、氨酸殘基上，導致親和力降低。半胱氨酸偶聯 半胱氨酸偶聯方法是基于抗體的半胱氨酸殘基與錨定在連接子上的特定硫基之間的反應。然而，與賴氨酸不同，野生型抗體中幾乎不存在游離巰基，它們主要通過減少二硫鍵生成。IgG1 含有 4 個鏈間和 12 個鏈內二硫鍵用于 ADC 構建，幸運的是，4 個鏈間二硫鍵通常對 IgG1 的結構穩定性不起關鍵作用，可以在溫和的條件下選擇性還原，生成 2、4、6 或8 個游離硫基，同時保持 12 個鏈內二硫鍵的完整性。因此，與基于賴氨酸的偶聯相比，明確的偶聯位點和特定的硫基反應有助于 ADC 控制DAR 和異質性。這種偶聯方法是 ADC 構建的主要選擇，許多 Her2 靶向

326、 ADC，如 RC48 和SYD985 等，都使用了這種偶聯方法。位點特異性偶聯 利用帶有工程化活性氨基酸殘基的抗體與連接子有效載荷偶聯是獲得位點特異性 ADC的可行方法。這些 ADC 的特點是偶聯均勻，DAR 為 2 或 4，表現出比傳統 ADC 更好的耐受性。ADCT-502 和 MEDI4276 就是基于這種技術生產的，不同之處在于，ADCT-502 將參與鏈間二硫鍵形成的八個半胱氨酸殘基中的六個突變為絲氨酸，在重鏈 220 位留下兩個半胱氨酸用于位點特異性偶聯，而MEDI4276將Fc區的S239和S442突變為半胱氨酸用于偶聯。不幸的是，這兩種 ADC 的臨床試驗都已經終止，可能是因

327、為無法忍受的毒性。該技術的另一個應用是將對乙酰苯丙氨酸基團帶入抗 Her2 抗體，以提供酮基作為與烷氧基胺衍生藥物形成穩定肟的反應位點。ARX788 ADC 是一種抗 Her2-p-乙酰苯丙氨酸-MMAF 偶聯物，可抑制異種移植腫瘤生長，目前處于 I/II 期臨床試驗階段。這種 ADC 的清除率和暴露參數與相應的裸抗非常相似。此外，不同于抗體工程化產生位點特異性偶聯，人們嘗試在抗體上產生化學和區域選擇性賴氨酸修飾，從而生成同質化的 ADC。A166 就利用了這種技術，其連接子偶聯到曲妥珠單抗上的輕鏈，目前處于 I/II 期臨床試驗階段。Her2 靶向 ADC 的臨床進展 處于研發前沿的幾種抗

328、Her2 靶向 ADC，如 DS-8201a、SYD985、RC48 和 ARX788，類似于 T-DM1，在乳腺癌治療中表現出優異的抗腫瘤活性。同時，其中一部分對其他 Her2 陽性癌癥顯示出顯著的臨床益處。在 II 期臨床試驗中，DS-8201a 在轉移性乳腺癌患者的治療方面取得了顯著改善，包括60.9%的客觀響應率（ORR）、16.4 個月的無進展生存期（PFS）和 12 個月的總生存期（OS）。Her2 陽性胃癌患者也從 DS-8201a 中獲得了顯著的臨床益處，ORR 為 43.2%，疾病控制率（DCR）為 79.5%，PFS 為 5.6 個月。在 Her2 突變型非小細胞肺癌中，O

329、RR 為 72.7%，PFS 中位數為 11.3 個月。116 RC48 在治療尿路上皮癌（ORR 51.2%，OS 13.9 個月，PFS 6.9 個月），胃癌（ORR 18.1%，PFS 3.8 個月，OS7.6 個月）和乳腺癌（ORR 36.7%，SD 60.0%）方面也表現出優越的臨床療效。此外，DS-8201a 和 RC48 在治療 Her-2 低表達患者方面也顯示出顯著的療效。在 Her2 IHC1+或 IHC2+乳腺癌分期試驗中，DS-8201a 的 ORR 為 37%，DCR 為 87%。在 Her2 陰性尿路上皮癌（IHC0 或 IHC1+）的多中心 II 期試驗中，RC48

330、 的 ORR 為 25%，DCR 為 75%。值得注意的是，ARX788 在治療 Her2 陽性胃癌患者方面顯示出顯著療效，20 名患者中有 9 名（45.5%）獲得 PR。2021 年 3 月，FDA 授予了 ARX788 針對 HER2+胃癌的孤兒藥資格。此外，Her2 靶向 ADC 的開發也不可避免地遇到了挫折，例如，BAT8001 由于未能達到III 期臨床試驗的終點而被終止，但整體的 Her2 靶向 ADC 藥物在 Her2 陽性癌癥治療中顯示出良好的前景。Her2 靶向 ADC 設計面臨的挑戰 ADC 分子的性質由各個組分的整體決定。對于 mAb、連接子、有效載荷、位點、偶聯類型和

331、所獲得的 DAR 的任何給定組合，產生的產物將由具有不同物理化學性質的 ADC 的混合物組成。產生的異質性可能會影響其穩定性、藥代動力學和清除率，從而對 ADC 的整體安全性和有效性產生不利影響。因此，精心選擇的組件集成是 ADC 成功的一個關鍵方面。隨著 ADC 技術的發展，ADC 分子的設計越來越多樣化，這既是機遇也是挑戰。在抗體方面，除了單克隆抗體，還可以選擇雙特異性抗體和納米抗體。有效載荷不僅限于細胞毒素，還包括蛋白質毒素、酶、放射性核素、核糖體抑制劑、siRNA 和免疫刺激劑等。在偶聯方面可選擇兩種類型的連接子：可切割和不可切割。偶聯技術方面，除了最常見的隨機、賴氨酸或半胱氨酸偶聯外

332、，還有多種位點特異性偶聯，包括通過工程半胱氨酸殘基、非天然氨基酸、特異性賴氨酸、糖基和酶介導的偶聯。DAR 值可以低至 2，也可以高至 12。新技術或新分子設計概念的引入是否一定能提高 ADC 的成功率？答案不得而知。例如，MEDI4276 是一種靶向 HER2 不同結構域的雙抗，與基于微管溶素的微管抑制劑有效載荷進行位點特異性偶聯，平均 DAR 為 4。它在體外顯示 Her2 陽性腫瘤細胞的細胞內化和細胞溶解增強，但在 I 期臨床試驗中，在劑量0.3 mg/kg 時，表現出不可耐受的毒性。XMT-1522 是另一種 ADC，由一種新型的全人抗 Her2 單抗和一種新型的基于 auristat

333、in的細胞毒性有效載荷組成，具有高 DAR 值。但該公司最終放棄了 XMT-1522，因為在一項針對乳腺癌患者的 1 期研究中，風險效益比令人失望。因此，分子設計仍然是 ADC 開發的重點和難點。小結 ADC 的發展將受益于治療性單克隆抗體設計的改進，以允許有效載荷在特定位點偶聯，從而實現更均勻的 ADC 藥物。偶聯策略和有效載荷釋放機制的多樣化可以提供更多的可能性來產生具有更好療效和安全性的 ADC。Her2 是一個經典靶點，目前有多款 Her2 靶向的ADC 處于臨床階段。相信隨著 ADC 技術的進步，在 Her2 陽性腫瘤的治療中，這些 ADC 藥物將顯著改善患者的生存狀況。117 參考文獻：1.Novel development strategies and challengesfor anti-Her2 antibody-drug conjugates.Antib Ther.20